硫辛酸對MPTP誘導(dǎo)的小鼠帕金森病模型的神經(jīng)保護作用*

任傳忠, 肖 猛, 李 瑋, 王紅偉

(1信陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院生理教研室， 信陽 464000； 2河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 鄭州 450000； 3河南科技大學(xué)護理學(xué)院， 洛陽 471000)

帕金森病(Parkinson disease，PD)是世界上第2常見的神經(jīng)退行性疾病，其典型臨床表現(xiàn)為靜態(tài)震顫、運動遲緩、僵硬和姿勢異常[1]。雖然PD的主要神經(jīng)病理學(xué)特征已被確定:含有α-突觸核蛋白的Lewy小體過度累積導(dǎo)致黑質(zhì)逐漸喪失多巴胺能神經(jīng)元[2]，但PD發(fā)生和發(fā)展的機制仍不清楚?，F(xiàn)有的PD治療手段只能部分緩解癥狀，幾乎不能減緩多巴胺能神經(jīng)元病變的進展[3]。因此，尋找更有效治療PD的藥物具有重要意義。

神經(jīng)炎癥的特征是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(包括小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞)的活化，并伴隨著促炎分子[如白細(xì)胞介素1β (interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)]以及氧化應(yīng)激反應(yīng)中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的增加[4]。PD的發(fā)病、進展與小膠質(zhì)細(xì)胞活化密切聯(lián)系[5]，且有文獻報道[6]，在PD患者的活檢顯示紋狀體和黑質(zhì)中有活化的小膠質(zhì)細(xì)胞積聚。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)炎癥對PD具有治療潛力。

α-硫辛酸 (alpha-lipoic acid，ALA)是一種抗氧化劑，同時具有水溶性和脂溶性的特征[7]。ALA可跨過血腦屏障，在大腦中可發(fā)揮抗氧化作用，具有改善癡呆的作用[8]。而ALA在PD中對神經(jīng)影響的研究成果尚不明確。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-mothyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)是一種神經(jīng)毒素，可通過損傷或破壞黑質(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元來誘發(fā)PD，并能在小鼠中引起典型的PD樣癥狀[9]。因此，本研究通過注射MPTP建立小鼠PD模型，隨后研究ALA對MPTP導(dǎo)致的運動缺陷、多巴胺能神經(jīng)元損傷、小膠質(zhì)細(xì)胞活化以及神經(jīng)炎癥的影響。

材 料 和 方 法

1 儀器與器材

MPTP、ALA、β-肌動蛋白(β-actin)抗體和酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)抗體購自Sigma-Aldrich；放射免疫沉淀測定(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液購自Solarbio；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自Thermo；IL-1β抗體購自Novus；離子鈣結(jié)合接頭分子1(ionized calcium-binding adaptor molecule-1, Iba-1)抗體、TNF-α抗體和COX-2 抗體購自Abcam；高效液相色譜儀、曠場實驗全自動記錄儀和轉(zhuǎn)棒測試儀購買自Med Associates。

2 實驗動物

36只SPF級7～8周雄性C517BL/6J小鼠[(23±3) g]，購自河南省實驗動物中心[SCXK(豫)2017-0001]。實驗動物均飼養(yǎng)在SPF級動物房中，小鼠可自由進食進水。所有實驗開展前，小鼠均在飼養(yǎng)環(huán)境下適應(yīng)一周。動物房室溫(22±1) ℃，晝夜循環(huán)12 h。所有動物實驗遵循我國《實驗動物護理和使用指南》執(zhí)行。

3 方法

3.1小鼠帕金森模型及分組 小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，隨機分為對照(control,Con)組、MPTP組和MPTP+ALA組，每組12只小鼠。MPTP組小鼠連續(xù)5 d腹腔注射MPTP(30 mg·kg-1·d-1)，第6～9天腹腔注射相同體積生理鹽水。MPTP+ALA組小鼠連續(xù)腹腔注射ALA(100 mg·kg-1·d-1)9 d，其中前5 d在注射MPTP(30 mg·kg-1·d-1)前2 h給藥。對照組連續(xù)9 d每天注射相同體積生理鹽水。其中每組2只小鼠用于中途評估模型構(gòu)建情況。本實驗最終納入每組10只小鼠進行統(tǒng)計。納入統(tǒng)計的小鼠在第10天進行后續(xù)研究。

3.2曠場實驗 造模結(jié)束后，用全自動曠場記錄儀進行曠場實驗。小鼠在實驗環(huán)境中適應(yīng)1 h，然后將小鼠放置在曠場中央，記錄小鼠在30 min的時間運動的總距離和平均速度。記錄儀在工作時，實驗環(huán)境無人。

3.3懸繩實驗 造模結(jié)束后，將每組小鼠進行懸繩實驗。小鼠在實驗環(huán)境中提前適應(yīng)1 h，然后將小鼠前肢放在水平鐵絲中間(直徑2 mm，長50 cm)。懸掛的小鼠傾向于用后后肢支撐，以避免摔倒并沿著鐵絲網(wǎng)走到平臺上。記錄180 s間摔倒和到達次數(shù)，分?jǐn)?shù)計算公式參考文獻[10]。

3.4轉(zhuǎn)棒實驗 造模結(jié)束后，將每組小鼠進行轉(zhuǎn)棒實驗。在240 s的記錄時間內(nèi)，以0.1 r·min-1·s-1的加速度從4 r/min開始恒定加速。每只小鼠進行3次，每次間隔40 min，計算3次掉落的平均時間。

3.5小鼠腦組織分離及切片 造模結(jié)束后，麻醉每組小鼠，快速解剖并收集完整腦組織，腦組織分為兩部分，一部分在冰上快速分離出紋狀體并儲存在-80 ℃下。另一部分腦組織在4 ℃下固定于4%多聚甲醛中過夜；然后依次采用20%和30%蔗糖溶液中脫水，用OCT包埋，-20 ℃冷凍24 h后，使用冷凍切片機連續(xù)切割獲得小鼠腦組織切片(8 μm)，并將其保存在-80 ℃下。

3.6免疫組化染色 每組小鼠腦片在0.6%的H2O2浸泡45 min后，PBS洗滌2次。然后腦片用0.2% Triton X-100通透30 min，接著置于10%山羊血清中，在37℃下封閉1 h。隨后采用I抗(TH 1 ∶1 500)在37℃條件下孵育2 h后，再4℃孵育過夜。次日，腦片用II抗(1 ∶200)在37℃條件下孵育1 h。隨后用AB過氧化物酶(1 ∶200)染色45 min，最后以DAB溶液顯色。在顯微鏡下隨機拍攝5個視野，通過ImageJ軟件統(tǒng)計陽性信號。

3.7免疫熒光實驗 每組小鼠腦片在室溫下用0.2% Triton X-100通透30 min，隨后用10%山羊血清在37 ℃下封閉1 h，然后在37 ℃下孵育I抗(TH 1 ∶1 500, Iba-1 1 ∶1 000)2 h后再4℃孵育過夜。次日，洗去I抗后滴加熒光II抗(1 ∶500)，室溫孵育1 h。DAPI(1 ∶1 000)室溫孵育30 min后，在熒光顯微鏡下觀察并隨機選取5個視野，通過ImageJ軟件統(tǒng)計陽性信號。

3.8高效液相色譜 每組小鼠紋狀體在0.4 mol/L HClO4中勻漿，隨后在11 050×g下4 ℃離心15 min，收集上清液。上清液經(jīng)BCA檢測蛋白濃度后，將上清液加入色譜儀中，采用高效液相色譜儀測定多巴胺(dopamine，DA)及其代謝物3,4-二羥基苯乙酸(3,4-dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)的含量。DA與DOPAC的含量表示為ng/g蛋白。

3.9免疫印跡實驗 用RIPA裂解液裂解每組小鼠腦組織并提取總蛋白后，用BCA法定量蛋白濃度。用RIPA裂解液調(diào)整蛋白濃度至一致(300)后，取同樣體積蛋白樣品電泳。電泳后，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至甲醇預(yù)活化的PVDF膜，100 V、2 h。轉(zhuǎn)模結(jié)束后以5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，I抗(β-actin 1 ∶1 500，TH 1 ∶1 500，IL-1β 1 ∶1 000，TNF-α 1 ∶1 000，COX-2 1 ∶1 000 ) 孵育2 h后后4 ℃過夜。第2天，以TBST洗滌，室溫孵育HRP標(biāo)記的II抗1 h，TBST洗滌后成像顯影。膠片進行掃描后，以β-actin為內(nèi)參照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的相對吸光度值。

3.10TH陽性細(xì)胞計數(shù) 每只小鼠腦片以Bregma點為基準(zhǔn)收集2.80～3.64 mm 6個切片，用DAB法進行TH染色。在顯微鏡下通過Stereo Investigator軟件統(tǒng)計TH陽性細(xì)胞總數(shù)。

3.11TH陽性細(xì)胞吸光度分析 每只小鼠腦片以Bregma點為基準(zhǔn)收集-1.60～0.00 mm 4個切片，用DAB法進行TH染色，光學(xué)顯微鏡下用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析。在減去背景吸光度值后，計算每只動物所有切片的平均值。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)，使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及最小顯著性差異法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ALA對MPTP誘導(dǎo)的小鼠運動缺陷的影響

在曠場實驗中，與對照組比較，MPTP組小鼠的總移動距離和平均運動速度均顯著降低(P<0.01)；與MPTP組比較，MPTP+ALA組小鼠的總移動距離和平均運動速度均顯著增加(P<0.05)，見圖1A、B。懸線實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，MPTP組小鼠懸線實驗的評分顯著降低(P<0.01)；與MPTP組比較，MPTP+ALA組小鼠的懸線實驗評分顯著增加(P<0.05)，見圖1C。轉(zhuǎn)棒實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，MPTP組小鼠下落潛伏期明顯增加(P<0.01)；與MPTP組比較，MPTP+ALA組小鼠下落潛伏期明顯降低(P<0.01)，見圖1D。

Figure 1. Effect of ALA on motor deficits in MPTP-induced PD mice. A: statistical results of the total distance in open-field test; B: statistical results of the average velocity in open-field test; C: statistical results of the hanging wire test scores; D： statistical results of the falling lantency in rotarod test. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsCon group;*P<0.05,**P<0.01vsMPTP group.
圖1 ALA對MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠運動缺陷的影響

2 ALA對MPTP處理后小鼠黑質(zhì)和紋狀體TH神經(jīng)元的作用

采用免疫組化方法檢測黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞數(shù)和紋狀體TH陽性神經(jīng)纖維密度，結(jié)果顯示，與對照組比較，MPTP組小鼠黑質(zhì)中TH陽性細(xì)胞數(shù)和紋狀體TH陽性神經(jīng)纖維密度均顯著降低(P<0.01)；與MPTP組比較，MPTP+ALA組小鼠黑質(zhì)中TH陽性細(xì)胞數(shù)和紋狀體TH陽性神經(jīng)纖維密度均顯著增加(P<0.01),見圖2。

Figure 2. Effect of ALA on TH expression in substantia nigra and striatum after MPTP treatment. A: representative immunohistochemical images for TH staining in the substantia nigra and statistical results of TH-positive cells; B: representative immunohistochemical images for TH staining in striatum and statistical results of TH-positive nerve fiber density. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsCon group;**P<0.01vsMPTP group.
圖2 ALA對MPTP處理后小鼠黑質(zhì)和紋狀體TH神經(jīng)元的作用

3 ALA對MPTP處理后小鼠紋狀體多巴胺釋放的作用

Western blot實驗顯示，與對照組比較，MPTP組小鼠紋狀體中TH表達顯著降低(P<0.01)；與MPTP組比較，MPTP+ALA組小鼠紋狀體中TH表達顯著增加(P<0.01),見圖3A。高效液相色譜結(jié)果顯示，與對照組比較，MPTP組小鼠紋狀體中DA和DOPAC水平均顯著降低(P<0.01)；與MPTP組比較，MPTP+ALA組小鼠紋狀體中DA和DOPAC水平均顯著升高(P<0.01)，見圖3B、C。

Figure 3. Effect of ALA on dopamine (DA) release in striatum after MPTP treatment. A: representative Western blot images and statistical results of TH expression in striatum; B: the level of DA in striatum was detected by high-performance liquid chromatography; C： the level of DOPAC in striatum was detected by high-performance liquid chromatography. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsCon group;**P<0.01vsMPTP group.
圖3 ALA對MPTP處理后的紋狀體多巴胺釋放的作用

4 ALA抑制MPTP誘導(dǎo)的紋狀體和黑質(zhì)中小膠質(zhì)細(xì)胞的活化

采用免疫組化和免疫熒光染色檢測小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Iba-1陽性細(xì)胞進行了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化研究。結(jié)果顯示，與對照組比較，MPTP組小鼠紋狀體和黑質(zhì)中中Iba-1陽性細(xì)胞數(shù)均顯著增加(P<0.01)；與MPTP組比較，MPTP+ALA組小鼠紋狀體和黑質(zhì)中Iba-1陽性細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P<0.01)。此外，MPTP小鼠腦組織中，小膠質(zhì)細(xì)胞體積變大、分支也明顯變多，細(xì)胞形態(tài)變化明顯，尤其是MPTP處理后的黑質(zhì)，見圖4。

Figure 4. ALA inhibits MPTP-induced the activation of microglia in striatum and substantia nigra. A: representative immunohistochemical images for Iba-1 staining in striatum and statistical results of Iba-1 positive cells; B: representative immunofluorescence images for TH and Iba-1 colocalization staining in substantia nigra and statistical results of Iba-1 positive cells in dopaminergic neurons of substantia nigra. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsCon group;**P<0.01vsMPTP group.
圖4 ALA抑制MPTP誘導(dǎo)的紋狀體和黑質(zhì)中小膠質(zhì)細(xì)胞活化

5 ALA對MPTP誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞因子的作用

Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，MPTP組小鼠紋狀體中COX-2、IL-1β 和TNF-α的表達均顯著增加(P<0.01)；與MPTP組比較，MPTP+ALA組小鼠紋狀體中COX-2、IL-1β 和TNF-α的表達均顯著降低(P<0.01),見圖5A。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對照組比較，MPTP組小鼠黑質(zhì)中小膠質(zhì)細(xì)胞的iNOS陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.01)；與MPTP組比較，MPTP+ALA組小鼠黑質(zhì)中小膠質(zhì)細(xì)胞的iNOS陽性細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.01)，見圖5B。

Figure 5. Effect of ALA on cytokines in microglia induced by MPTP. A: representative Western blot images and statistical results of the expression levels of COX-2, IL-1β and TNF-α in striatum; B: representative immunofluorescence images for iNOS (red) and Iba-1 (green) colocalization staining (arrows) in substantia nigra and colocalization rate of iNOS and Iba-1. Mean±SEM.n=10.##P<0.01vsCon group;**P<0.01vsMPTP group.
圖5 ALA對MPTP誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞因子的作用

討 論

PD是一種發(fā)病率僅次于阿爾茨海默病的神經(jīng)退行性疾病，是全球第2大常見的神經(jīng)退行性疾病[11]，影響著約1%的60歲以上人群[12]。目前常用的PD治療方案雖能減輕患者的癥狀，但并不能改善疾病進展[3]。因此，尋找更有效治療PD的藥物具有重要意義。

ALA臨床上主要用于糖尿病多發(fā)性神經(jīng)病及心血管損傷等糖尿病并發(fā)癥的治療[13]，且ALA可跨過血腦屏障，在大腦中發(fā)揮抗氧化作用[8]。已有文獻[14]在6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞PD模型中，ALA能抑制6-OHDA誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。在魚藤酮誘導(dǎo)大鼠PD模型中，ALA能減輕魚藤酮誘導(dǎo)的PD大鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平[15]，這些結(jié)果提示ALA具有治療PD的潛在作用。MPTP是PD研究中常用的神經(jīng)毒素，可選擇性損傷多巴胺能神經(jīng)元并誘導(dǎo)動物的PD樣行為[16]。本研究在MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠中通過曠場實驗、懸繩實驗以及轉(zhuǎn)棒實驗證實ALA能抑制MPTP導(dǎo)致的運動障礙。PD的典型病理特征包括黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失和紋狀體區(qū)多巴胺能突觸末端的丟失[2]。為確定ALA是否能保護多巴胺能神經(jīng)元免受MPTP損傷，本研究結(jié)果表明，ALA能抑制PD小鼠黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的丟失和紋狀體中TH神經(jīng)纖維密度降低，且能促進PD小鼠紋狀體中DA和DOPAC釋放。本研究提示，ALA能顯著改善MPTP引起的PD小鼠多巴胺能神經(jīng)元損傷。

目前研究普遍認(rèn)為，源自小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥介質(zhì)會加重PD患者巴胺能神經(jīng)元退化的進展[4, 17]。小膠質(zhì)細(xì)胞是一種存在于大腦的免疫細(xì)胞，在神經(jīng)炎癥過程中起著核心作用[18]。在PD早期，患者的大腦中小膠質(zhì)細(xì)胞會發(fā)生慢性炎癥[19]，并且通過正電子發(fā)射斷層成像證實了PD患者中持續(xù)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞[20]。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞促進促炎分子和活性氧的產(chǎn)生，使多巴胺能神經(jīng)元更容易退化[17, 21]。因此，本研究檢測了ALA對PD小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞活化以及炎癥因子的影響，研究結(jié)果表明，ALA能降低PD小鼠黑質(zhì)和紋狀體中反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞活化，且，ALA能抑制PD小鼠紋狀體中炎性因子IL-1β、TNF-α和COX-2的表達。另外，本研究還顯示，ALA能降低PD小鼠黑質(zhì)中小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS的水平。然而作為一種抗氧化劑，ALA在減少小膠質(zhì)細(xì)胞中的抗炎作用機理還需要進一步解釋。并且由于氧化應(yīng)激是一個復(fù)雜的過程，ALA在氧化應(yīng)激中的作用尚待深入研究。

綜上所述，本項工作顯示，ALA能降低MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠的反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)炎癥，減輕黑質(zhì)和紋狀體多巴胺能神經(jīng)元退化并改善運動缺陷，在MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。