滋陰清熱藥和強(qiáng)的松對(duì)狼瘡小鼠血清ABTS、MDA及抗ds-DNA抗體的影響

張保平，程喜平，李楠，凡慧，梁康禮，胡小倩，張穗盈，鄧育瓊，吳元?jiǎng)?/p>

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)金沙洲醫(yī)院 中醫(yī)科，廣東 廣州 510168；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 皮膚科，廣東 廣州 510120；3.廣東省中醫(yī)院 皮膚科，廣東 廣州 510120)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)病因不清，中西醫(yī)結(jié)合治療SLE具有鮮明特色，滋陰清熱藥是國醫(yī)大師禤國維教授根據(jù)長期的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)治療SLE的方劑，臨床療效確切[1]。研究顯示，眾多中藥具有良好的抗氧化的作用[2]。SLE的氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，活性氧異常升高，值得關(guān)注的是，作為治療SLE的常用藥物，糖皮質(zhì)激素能增強(qiáng)氧化應(yīng)激反應(yīng)，增加活性氧的生成[3]。中藥可以抑制活性氧產(chǎn)生，減少對(duì)機(jī)體的損害[4]。滋陰清熱藥是治療SLE有效的方劑，深入研究滋陰清熱藥抗氧化作用及其生物學(xué)意義，對(duì)于探索滋陰清熱方劑的臨床應(yīng)用具有積極意義。為此，本研究觀察滋陰清熱藥和強(qiáng)的松對(duì)MRL/lpr狼瘡小鼠血清2，2-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)[2,2-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS]、丙二醛(malondialdehyde，MDA)及抗ds-DNA抗體(anti-double stranded DNA antibody，anti-ds-DNA antibody)的影響，具體如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組24只雌性MRL/lpr狼瘡小鼠模型鼠，12周齡，體質(zhì)量25.1～30.4 g，中位體質(zhì)量27.6 g。將其隨機(jī)分為4組：滋陰清熱藥組、強(qiáng)的松組、滋陰清熱藥和強(qiáng)的松合用組(合用組)、空白對(duì)照組。動(dòng)物均購自南京大學(xué)動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：44007200001471。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥滋陰清熱方組：山萸肉15 g、生地黃20 g、茯苓15 g、澤瀉15 g、牡丹皮15 g、青蒿8 g、甘草6 g(由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房提供)，水煎后，濃縮處理(中藥含藥量為94 g)，生藥濃度為1.5 g·L-1，按照0.02 mL·g-1劑量灌胃，每日1次。強(qiáng)的松組：配制0.3 g·L-1的強(qiáng)的松(上海醫(yī)藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H31020675)藥液，按照0.02 mL·g-1劑量灌胃，每日1次。合用組：同時(shí)接受滋陰清熱藥和強(qiáng)的松藥液灌胃，方法和劑量同前?？瞻讓?duì)照組：接受0.6 mL生理鹽水灌胃，每日1次。均干預(yù)治療3個(gè)月。

1.3 方法和試劑治療3個(gè)月后脫頸處死小鼠，心臟取血，血液在37 ℃條件下靜置30 min，3 000 r·min-1離心10 min后取血清進(jìn)行ABTS、MDA和抗ds-DNA抗體檢測(cè)。

1.3.1ABTS檢測(cè) 采用快速ABTS法(碧云天，上海，中國)檢測(cè)標(biāo)本的總抗氧化能力，并用mmol·g-1蛋白表示。(1)配制ABTS母液：ABTS溶液100 μL，氧化劑溶液100 μL，室溫避光存放12 h。(2)配制ABTS工作液：在使用前用PBS稀釋母液，ABTS母液200 μL，PBS 7 800 μL。(3)待測(cè)樣品的準(zhǔn)備：血液在37 ℃條件下靜置30 min，3 000 r·min-1離心10 min后取血清，血清可直接用于測(cè)定。(4)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液：使用PBS把10 mmol·L-1Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.15、0.30、0.60、0.90、1.20和1.50 mmol·L-1。(5)總抗氧化能力的測(cè)定：①96孔板的每個(gè)檢測(cè)孔中加入200 μL ABTS工作液；②空白對(duì)照孔中加入10 μL PBS溶液，標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)孔內(nèi)加入10 μL各種濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品檢測(cè)孔內(nèi)加入10 μL血清樣品，輕輕混勻；③室溫孵育2～6 min后，采用Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀，Thermo Fisher測(cè)定734 nm的吸光度值。

1.3.2MDA檢測(cè) 采用脂質(zhì)過氧化法和硫代巴比妥酸法測(cè)定血清MDA水平(碧云天，上海)，單位：μmol·g-1。(1)配制TBA儲(chǔ)存液：采用TBA配制液加熱到70 ℃以促進(jìn)溶解，配制成質(zhì)量濃度為3.7 g·L-1的TBA儲(chǔ)存液。(2)配制MDA檢測(cè)工作液：TBA稀釋液1 500 μL，TBA儲(chǔ)存液500 μL，抗氧化劑30 μL。(3)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：取適量標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水稀釋至1、2、5、10、20、50 μmol·L-1，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。(4)樣品測(cè)定：①每管加入0.1 mL PBS等適當(dāng)溶液作為空白對(duì)照，加入0.1 mL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，加入0.1 mL血清，隨后加入0.2 mL MDA檢測(cè)工作液；②混勻后，100 ℃水浴加熱15 min；③水浴冷卻至室溫，1 000 g室溫離心10 min，取200 μL上清加入到96孔板中，隨后用酶標(biāo)儀在532 nm測(cè)定吸光度。④計(jì)算MDA：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得MDA的摩爾濃度。

1.3.3血清抗dsDNA抗體檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定血清抗ds-DNA抗體，按試劑盒說明進(jìn)行相關(guān)操作。在分光檢側(cè)儀上讀取450 nm波長的OD值。

2 結(jié)果

滋陰清熱藥組ABTS水平高于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；強(qiáng)的松組ABTS水平低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。強(qiáng)的松組MDA水平高于其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。滋陰清熱藥組、強(qiáng)的松組、合用組抗ds-DNA抗體水平均低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；滋陰清熱藥組、強(qiáng)的松組、合用組抗ds-DNA抗體水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 滋陰清熱藥對(duì)MRL/lpr狼瘡小鼠血清ABTS、MDA及抗ds-DNA的影響

注：ABTS—2,2-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)；MDA—丙二醛。

3 討論

正常生理狀態(tài)下，機(jī)體氧化還原反應(yīng)可以產(chǎn)生低劑量的ROS，對(duì)維持機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和功能有重要意義。病理狀態(tài)下，氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生超量ROS對(duì)機(jī)體十分有害，不僅可以引起氧化，形成氧化終產(chǎn)物，如丙二醛，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，從而喪失功能，也能引起細(xì)胞DNA受損，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，還能通過多種途徑誘發(fā)免疫炎癥，引起組織器官損害[5]。SLE是一種多器官受累的自身免疫性疾病。研究顯示，SLE氧化應(yīng)激反應(yīng)過度，生成超量活性氧，引起免疫炎癥因子異常升高，應(yīng)用活性氧拮抗劑干預(yù)氧化應(yīng)激，抑制或減少超量活性氧的形成，可以降低炎癥因子水平和血清抗ds-DNA抗體濃度[6]，從而緩解病情。很多植物類食物具有良好的抗氧化作用，可以減少哺乳動(dòng)物活性氧的超量產(chǎn)生。中藥同樣具有良好的抗氧化作用，可以減少活性氧超量生成，減輕免疫炎癥。理論上，中藥抗氧化作用有益于SLE病情緩解。滋陰清熱藥是國醫(yī)大師禤國維教授臨床治療紅斑狼瘡的有效方劑，中藥復(fù)方成分復(fù)雜，作用靶點(diǎn)多，研究和闡明中藥有效方劑的機(jī)制一直是努力的方向。

ABTS法是一種常用的抗氧化檢測(cè)方法，抗氧化劑清除能力以ABTS吸光度大小與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑比值做指標(biāo)，比值越高，抗氧化能力越強(qiáng)[7]。本研究結(jié)果顯示，滋陰清熱藥組ABTS水平高于強(qiáng)的松組、合用組和空白對(duì)照組，說明滋陰清熱藥具有良好的抗氧化作用，提示滋陰清熱藥可以通過抗氧化途徑緩解SLE的病情。本研究結(jié)果還顯示，強(qiáng)的松組的抗氧化作用低于空白對(duì)照組，強(qiáng)的松加重氧化應(yīng)激反應(yīng)，理論上可以誘導(dǎo)免疫炎癥加重。因此，單獨(dú)從氧化應(yīng)激反應(yīng)角度評(píng)價(jià)強(qiáng)的松對(duì)SLE作用，不利于病情緩解。強(qiáng)的松是臨床上SLE主要用藥，在控制免疫炎癥進(jìn)行性加重，穩(wěn)定病情方面具有一定療效，但強(qiáng)的松也有一系列不良反應(yīng)，目前未查閱到糖皮質(zhì)激素加重SLE氧化應(yīng)激反應(yīng)后對(duì)其病情活動(dòng)進(jìn)一步影響的報(bào)道。機(jī)體的免疫系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，深入研究強(qiáng)的松加重氧化應(yīng)激反應(yīng)的意義，對(duì)于減輕糖皮質(zhì)激素的副作用，改善SLE治療現(xiàn)狀具有積極意義。

滋陰清熱藥和強(qiáng)的松在抗氧化應(yīng)激過程中的作用不同。強(qiáng)的松是公認(rèn)治療SLE有效藥物，滋陰清熱藥同樣是治療SLE的有效藥物。為進(jìn)一步明確滋陰清熱藥和強(qiáng)的松抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的不同作用可能產(chǎn)生的臨床意義，本研究對(duì)各組進(jìn)行了血清氧化終端產(chǎn)物MDA和抗ds-DNA抗體檢測(cè)。結(jié)果顯示，強(qiáng)的松組MDA水平高于其他3組，機(jī)體內(nèi)存在大量的不飽和脂肪酸，極易受到過氧化作用的損傷。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)鏈?zhǔn)降慕K端小分子產(chǎn)物之一，是目前公認(rèn)能反映活性氧超量產(chǎn)生并引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的指標(biāo)。MDA不僅是生物體氧化應(yīng)激的標(biāo)志物，還具有很強(qiáng)的毒副作用，其作用機(jī)制是極易與生物分子中的氨發(fā)生非特異性反應(yīng)，導(dǎo)致分子內(nèi)或分子間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)嚴(yán)重的細(xì)胞毒性、遺傳毒性、神經(jīng)毒性、致突變或致癌變作用等[8]。糖皮質(zhì)激素的副作用是否和MDA有關(guān)需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果還顯示，滋陰清熱藥組在抗氧化方面有良好的生物效果，MDA水平低于強(qiáng)的松組，兩者不同作用特點(diǎn)的臨床意義值得深入研究。本研究結(jié)果顯示，滋陰清熱藥組、強(qiáng)的松組、合用組的血清抗ds-DNA抗體水平均低于空白對(duì)照組，合用組、滋陰清熱藥組、強(qiáng)的松組抗ds-DNA抗體水平無明顯差異。以往研究顯示，SLE患者氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，在活性氧激化下，抗ds-DNA抗體水平可異常升高，并加重SLE損害[9]。Maeshima等[10]發(fā)現(xiàn)維生素E通過減輕活性氧對(duì)DNA結(jié)構(gòu)，特別是線粒體結(jié)構(gòu)的損害，減少抗ds-DNA抗體生成。N-乙酰半胱氨酸是外源性活性氧拮抗劑，口服NAC可顯著降低MRL/lpr狼瘡小鼠血清自身抗體水平，改善狼瘡性腎炎[11]。本研究結(jié)果提示：盡管滋陰清熱藥和強(qiáng)的松抗氧化作用截然不同，滋陰清熱藥具有抗氧化作用，而強(qiáng)的松則能加重氧化作用，但兩者降低抗ds-DNA抗體水平卻一致，提示滋陰清熱藥治療SLE作用機(jī)制可能不同于糖皮質(zhì)激素，滋陰清熱藥和強(qiáng)的松對(duì)SLE具有良好的協(xié)同作用。合用組抗ds-DNA抗體水平低于滋陰清熱藥組和強(qiáng)的松組，推測(cè)滋陰清熱藥和強(qiáng)的松可能存在共同的作用機(jī)制，能有效平衡兩者抗氧化差異，顯示中西醫(yī)結(jié)合協(xié)同作用仍是主要方面。

綜上，強(qiáng)的松是治療SLE主要臨床用藥，控制SLE病情的同時(shí)也有明顯的副作用。滋陰清熱藥組在抗氧化方面作用優(yōu)于強(qiáng)的松，在抗氧化終端產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生中也優(yōu)于強(qiáng)的松，提示滋陰清熱藥治療SLE具有優(yōu)勢(shì)和特色。因此，循著抗氧化的途徑，深入研究滋陰清熱藥新的作用途徑，探索滋陰清熱藥的有效成分，可能取得療效更佳、副作用更小的治療SLE的有效成分，有益于推動(dòng)研制具有中醫(yī)特色且療效較好的SLE新藥。