基于全細(xì)胞RC電路的細(xì)胞阻抗響應(yīng)模型的建立與分析

杜向斌，孔金龍，王楷群，黃 棣，1b，陳維毅，1b，單彥虎

(1.太原理工大學(xué) a.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，納米生物材料與再生醫(yī)學(xué)研究中心，b.生物醫(yī)學(xué)工程研究所，材料強(qiáng)度與結(jié)構(gòu)沖擊山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030024；2.中北大學(xué) 儀器與電子學(xué)院，太原 030051)

細(xì)胞是生物體的基本單元。眾多研究已經(jīng)表明細(xì)胞電學(xué)特性與細(xì)胞分裂、分化、增殖、遷移、凋亡等細(xì)胞功能緊密相關(guān)。近年來，細(xì)胞電學(xué)特性的研究，受到科學(xué)家們的廣泛關(guān)注。MIGUEL et al[1]采用微流控阻抗細(xì)胞計(jì)數(shù)法對(duì)骨骼干細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)其在擴(kuò)增的過程中膜電容增大，其阻抗值也隨增殖過程逐漸增大，該項(xiàng)研究結(jié)果可用于區(qū)分骨髓中的骨骼干細(xì)胞。LIU et al[2]研究表明鐮刀狀紅細(xì)胞的血漿電導(dǎo)率低于正常紅細(xì)胞，并且其細(xì)胞內(nèi)部的相對(duì)介電常數(shù)較大。

檢測細(xì)胞電學(xué)特性的技術(shù)手段眾多，其中，細(xì)胞阻抗傳感器在細(xì)胞功能表征方面得到了非常廣泛的應(yīng)用，其最先由GIAEVER和KEESE兩人提出[3]，可以實(shí)現(xiàn)免標(biāo)記實(shí)時(shí)監(jiān)測細(xì)胞的電學(xué)特性。當(dāng)不同生理/病理狀態(tài)的細(xì)胞在微電極上培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞及其內(nèi)部各部分電學(xué)特性的異質(zhì)性影響細(xì)胞-電極間的電流通路，整個(gè)系統(tǒng)的阻抗發(fā)生改變，進(jìn)而表征細(xì)胞實(shí)時(shí)功能狀態(tài)。RAJAPAKSHA et al[4]基于細(xì)胞阻抗傳感測試原理，制作了非侵入式生物傳感器，發(fā)現(xiàn)不同種類的腫瘤細(xì)胞顯示出不同的阻抗值。STANICA et al[5]利用細(xì)胞阻抗傳感器發(fā)現(xiàn)低氧條件下人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞在加入碳酸酐酶抑制劑乙酰唑胺時(shí)，細(xì)胞阻抗實(shí)部顯著性降低。LUO et al[6]利用阻抗傳感器研究4種不同的抗癌試劑對(duì)胃腸癌細(xì)胞阻抗變化的影響，發(fā)現(xiàn)加入復(fù)方苦參注射液(CKI)后阻抗急劇下降；加入華蟾素注射液后阻抗只產(chǎn)生輕微地變化；轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)和5-氟尿嘧啶(5-FU)也會(huì)引起了阻抗的下降。將上述試驗(yàn)測試結(jié)果與簡易R(shí)C模型擬合，可以提取出不同生理/病理狀態(tài)細(xì)胞的等效電容值與電阻值。盡管這些研究可以為細(xì)胞功能的表征提供有效的手段，但是對(duì)于細(xì)胞電學(xué)特性的變化對(duì)特定細(xì)胞功能的阻抗響應(yīng)機(jī)理研究還不夠充分，進(jìn)而細(xì)胞電學(xué)特性與細(xì)胞功能之間的深入聯(lián)系還需進(jìn)一步的研究。

考慮到細(xì)胞電學(xué)特性的特異性對(duì)于阻抗測試的影響，對(duì)細(xì)胞電學(xué)特性模型的研究就顯得非常有必要，如KOTNIK et al[7]建立了具有介電弛豫的細(xì)胞介電模型，來研究細(xì)胞處于不同頻率的電場下所引起的功耗；SOLEIMANI et al[8]建立了一種簡潔且可重構(gòu)的細(xì)胞模型，用以表達(dá)鈣離子動(dòng)力學(xué)的各種非線性響應(yīng)；HODGKIN和HUXLEY[9]利用雙電極電壓技術(shù)提出細(xì)胞膜模型(H-H模型)，該模型不僅揭示了細(xì)胞膜的離子交換機(jī)制，還預(yù)測了細(xì)胞膜上的鈉鉀通道；KANAI et al[10]認(rèn)為細(xì)胞外液、細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞內(nèi)容物可以分別用并聯(lián)的電容和電阻來描述，由此可以得出一個(gè)簡單的細(xì)胞RC電路模型；MANSOORIFAR et al[11]利用電路模型，直觀地解釋了利用介電譜技術(shù)來表征細(xì)胞介電特性的原理；姚陳果等[12]將細(xì)胞電路模型運(yùn)用在研究外加不同頻率的電刺激對(duì)細(xì)胞膜電位的影響。

建立模型定量分析不同細(xì)胞電學(xué)特性在測試過程中產(chǎn)生不同響應(yīng)的機(jī)理對(duì)于細(xì)胞電學(xué)特性在細(xì)胞功能檢測以及表征等方面有著非常重要的作用。針對(duì)于不同類型不同功能的細(xì)胞的阻抗響應(yīng)，已有研究僅僅把細(xì)胞等效成為一組簡單的RC電路，擬合的結(jié)果不能全面反映細(xì)胞內(nèi)部各組件電學(xué)特性改變對(duì)于阻抗異質(zhì)性響應(yīng)的影響。例如，已有研究表明正常紅細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)電容遠(yuǎn)小于鐮狀紅細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)電容[13]，因此，上述等效模型并不能反映阻抗響應(yīng)的機(jī)理。

細(xì)胞阻抗響應(yīng)受頻率調(diào)控，其原因是與細(xì)胞的電學(xué)特性和粘附性有關(guān)[14]。因此，本文旨在通過模型分析不同細(xì)胞電學(xué)特性下細(xì)胞阻抗響應(yīng)異質(zhì)性的機(jī)理。模型中，采用等效電路模型將細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等組分的電學(xué)特性直觀地等效成響應(yīng)的電學(xué)元件?？紤]到實(shí)際細(xì)胞阻抗測試中的環(huán)境因素對(duì)于整體阻抗響應(yīng)有很重要的影響，模型中考慮了電極、培養(yǎng)液電學(xué)特性以及電極-培養(yǎng)液的電化學(xué)反應(yīng)。本研究為深入分析不同生理/病理狀態(tài)下細(xì)胞的不同阻抗響應(yīng)提供了有力的理論支持；同時(shí)，本模型可以定量地描述細(xì)胞對(duì)測量阻抗的影響，以及分析細(xì)胞阻抗的頻率特性，并且對(duì)實(shí)際實(shí)驗(yàn)中參數(shù)等的選擇提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)方法

當(dāng)細(xì)胞生長在電極上時(shí)，電流穿過細(xì)胞下面與電極之間的間隙，然后分為穿過細(xì)胞膜的電流和穿過細(xì)胞間的電流，由于細(xì)胞電學(xué)特性的異質(zhì)性，導(dǎo)致不同生理/病理狀態(tài)下的細(xì)胞中兩部分電流占總電流的比重不同。具體流程如圖1所示。

圖1 細(xì)胞生長在電極上的電流通路

1.1 電極等效電路模型

阻抗測試實(shí)驗(yàn)中，電極浸泡于培養(yǎng)液中用于實(shí)時(shí)免標(biāo)記檢測細(xì)胞的阻抗響應(yīng)。電極與培養(yǎng)液間的電化學(xué)反應(yīng)可用Randles模型來描述，Randles模型通常用于電化學(xué)阻抗譜(EIS)中，是描述電化學(xué)界面上反應(yīng)過程的模型之一，由雙層電容Cdl與法拉第反應(yīng)阻抗的并聯(lián)組合再串聯(lián)活性電解質(zhì)電阻Rs組成，法拉第反應(yīng)的阻抗由電荷轉(zhuǎn)移電阻Rct和Warburg擴(kuò)散元件組成，其等效電路如圖2所示[15]。在Randles模型基礎(chǔ)上，將電極等效電路模型等效成為如圖3所示的電路圖。模型中引入的常相角元件CPE用于解釋實(shí)驗(yàn)過程中電極阻抗對(duì)于不同頻率響應(yīng)的現(xiàn)象。CPE的阻抗值表示為：

(1)

式中：Q是CPE阻抗大??；ω是角頻率；n是常數(shù)(0

圖2 Randles模型

圖3 電極等效電路模型

CPE是根據(jù)實(shí)際觀測結(jié)果抽象出來的一種元件。由于其不是實(shí)際的電子元件，因此很難直接利用CPE的公式分析電極的電學(xué)特性影響。已有研究表明可以采用多個(gè)RC電路的組合模擬CPE元件的實(shí)際響應(yīng)。本模型中，將3組RC并聯(lián)電路串聯(lián)用以實(shí)現(xiàn)CPE元件的特性的表征，如圖4所示。該模型部分的阻抗如式(2)所示。模型中的各個(gè)參數(shù)通過最小二乘法擬合得到[16]。

(2)

圖4 CPE等效電路圖

1.2 細(xì)胞-電極等效電路模型

圖5 電極與細(xì)胞的等效電路模型

細(xì)胞-電極的總阻抗可以表示為：

Ztotal=Zcell+Zelectrode.

(3)

(4)

(5)

式(6)—式(7)顯示了系統(tǒng)總阻抗和總相位角：

Z=R+jX.

(6)

(7)

模型中，采用球形外殼電容器來描述細(xì)胞膜和細(xì)胞核膜的電學(xué)特性，采用導(dǎo)電球體模型描述細(xì)胞質(zhì)的電學(xué)特性，進(jìn)而確定細(xì)胞內(nèi)各結(jié)構(gòu)的電容電阻值。當(dāng)細(xì)胞處于電場中時(shí)，由電磁場理論可知，細(xì)胞膜和細(xì)胞核膜的漏電導(dǎo)與電容值可如式(8)—式(9)來表示，細(xì)胞質(zhì)的漏電導(dǎo)與電容值可如式(10)—(11)來表示[20]。

(8)

(9)

G=4πσR.

(10)

C=4πεε0R.

(11)

式中：內(nèi)、外半徑分別為r1和r2；電導(dǎo)率和相對(duì)介電常數(shù)分別為σ與ε.

1.3 模型參數(shù)的選擇

不同生理/病理狀態(tài)的細(xì)胞顯示了不同的介電常數(shù)，進(jìn)而導(dǎo)致不同的細(xì)胞電學(xué)特性。本模型采用的細(xì)胞電學(xué)特性參數(shù)參考文獻(xiàn)[21-22]，電極參數(shù)根據(jù)已有實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)中的測試結(jié)果擬合得到[23]，全部模型參數(shù)如表1所示。

表1 電路模型各參數(shù)的值

2 結(jié)果與分析

2.1 模型驗(yàn)證

為了驗(yàn)證模型的合理性，通過擬合不同尺寸的細(xì)胞在不同頻率下的阻抗響應(yīng)[24]以及細(xì)胞種植于導(dǎo)電聚合物基底前后阻抗響應(yīng)的變化[25]的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來驗(yàn)證本文建立的模型的合理性。模型中，細(xì)胞直徑的變化會(huì)影響細(xì)胞膜細(xì)胞質(zhì)的電容電阻值，細(xì)胞的數(shù)量由細(xì)胞間電阻Rcell控制。因此，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜細(xì)胞質(zhì)電容電阻值以及Rcell來擬合不同尺寸細(xì)胞阻抗響應(yīng)的變化，擬合結(jié)果如圖6所示。圖7顯示了阻抗傳感器電極上種植細(xì)胞前后系統(tǒng)整體阻抗變化的擬合結(jié)果。上述結(jié)果表明，本文提出的模型較為合理地用于描述細(xì)胞阻抗響應(yīng)變化的原因。

實(shí)線代表實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，虛線代表模型擬合結(jié)果

實(shí)線代表實(shí)驗(yàn)結(jié)果，虛線代表模型擬合結(jié)果

2.2 細(xì)胞膜電阻Rm影響的分析

當(dāng)細(xì)胞功能改變時(shí)，細(xì)胞膜自身的電學(xué)特性發(fā)生響應(yīng)改變。例如，當(dāng)細(xì)胞處于有絲分裂期間，細(xì)胞大小和形態(tài)的改變，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜電容電阻的變化。圖8(a)顯示隨著頻率增大，系統(tǒng)整體阻抗的幅值逐漸變小。當(dāng)頻率較小時(shí)，初始電流主要從細(xì)胞間穿過，當(dāng)頻率增大時(shí)，穿過細(xì)胞膜電流的比例逐漸增大，因此，整體阻抗呈現(xiàn)逐步下降的趨勢(shì)。當(dāng)細(xì)胞膜電阻隨細(xì)胞功能變化而變化時(shí)，系統(tǒng)總體阻抗隨頻率變化的趨勢(shì)保持一致，但是總體阻抗幅值的低頻增益隨著細(xì)胞膜電阻的增加而增加，與此同時(shí)，頻率帶寬隨細(xì)胞膜電阻的增加而減小，詳細(xì)數(shù)據(jù)如圖9所示。由此可知，細(xì)胞膜電阻變化可以表征細(xì)胞對(duì)應(yīng)生物功能變化的敏感性。當(dāng)阻抗虛部小于0時(shí)，電路呈現(xiàn)電容特性；當(dāng)阻抗虛部等于0時(shí)，電路呈現(xiàn)電阻特性。圖8(b)顯示了阻抗角與頻率之間的關(guān)系。以細(xì)胞膜電阻為5.5 kΩ的情況為例，當(dāng)處于低頻率階段時(shí)，系統(tǒng)阻抗角趨近于0，但是在頻率增大的過程中，系統(tǒng)呈現(xiàn)增強(qiáng)的電容特性，在0.4 MHz頻率下，顯示最強(qiáng)的電容特性，在此后階段，系統(tǒng)電容特性稍有減弱。然而，細(xì)胞膜電阻增大會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)可以在更低的頻率下就出現(xiàn)電容特性，并且系統(tǒng)電容特性進(jìn)一步增強(qiáng)(Rm=55 MΩ時(shí)，在2 kHz頻率下，阻抗角達(dá)到最大值-70°)，并且隨著頻率的進(jìn)一步增大，系統(tǒng)能夠在較強(qiáng)電容特性情況下保持較長階段?？赡苁且?yàn)榧?xì)胞膜電阻變化時(shí)改變了細(xì)胞內(nèi)各結(jié)構(gòu)之間電學(xué)參數(shù)的耦合關(guān)系，使得阻抗虛部在頻率增大時(shí)越來越小于0.

圖8 細(xì)胞膜電阻對(duì)系統(tǒng)整體阻抗幅頻和相頻特性的影響

圖9 細(xì)胞膜電阻對(duì)于系統(tǒng)阻抗幅值低頻增益以及帶寬變化的影響

2.3 細(xì)胞膜電容Cm影響的分析

圖10(a)顯示當(dāng)頻率增大時(shí)，系統(tǒng)整體阻抗幅值下降，但與細(xì)胞膜電阻的影響相比，在其生理取值范圍內(nèi)，細(xì)胞膜電容對(duì)于阻抗幅值的影響在較高頻率范圍內(nèi)(>105 Hz)較為明顯。隨著細(xì)胞膜電容的增大，系統(tǒng)總體阻抗的幅值可在更小的頻率時(shí)下降。圖11顯示了系統(tǒng)阻抗幅值的下降斜率以及帶寬隨細(xì)胞膜電容增大時(shí)的變化情況，清晰表明了阻抗幅值特性對(duì)于細(xì)胞膜電容的敏感性。圖10(b)顯示了系統(tǒng)阻抗角隨頻率變化的情況。當(dāng)Cm取值為0.158 pF時(shí)，阻抗角在頻率大于103 Hz時(shí)，開始下降，在104 Hz到5 105 Hz范圍內(nèi)，呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)(≈-20°)，隨后頻率繼續(xù)增大時(shí)，阻抗角線性下降至-60°.當(dāng)細(xì)胞膜電容增大時(shí)，阻抗角隨頻率增大近似線性下降至-60°，電容增大可促進(jìn)在更小的頻率到達(dá)最顯著的電容性特征，隨后系統(tǒng)向電容特征減弱的方向趨近，并無穩(wěn)定電容特性階段出現(xiàn)。該研究表明細(xì)胞膜電容變化導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部電學(xué)參數(shù)耦合關(guān)系不同，最終導(dǎo)致系統(tǒng)阻抗表現(xiàn)出不同的趨勢(shì)。

圖11 細(xì)胞膜電容對(duì)于系統(tǒng)阻抗幅值帶寬以及下降斜率變化的影響

2.4 細(xì)胞間電阻Rcell的影響

細(xì)胞增殖或者凋亡的過程中，由于細(xì)胞數(shù)量的增多或者減小，細(xì)胞間距會(huì)發(fā)生變化，進(jìn)而會(huì)影響穿過細(xì)胞間的電流。細(xì)胞間電流大小可通過等效成為一個(gè)電阻Rcell來表征，電阻連接位置如圖5所示。Rcell增大代表細(xì)胞間間距減小。圖12顯示了同樣在頻率增大時(shí)系統(tǒng)阻抗幅值響應(yīng)逐步下降的趨勢(shì)，表明系統(tǒng)阻抗對(duì)于頻率的依賴特性。在細(xì)胞增殖的過程中，細(xì)胞間電阻逐步增大，進(jìn)而使得系統(tǒng)總阻抗幅值呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，但是與細(xì)胞膜電阻變化下的趨勢(shì)相比，系統(tǒng)阻抗幅值在大于截止頻率的范圍內(nèi)下降較為平緩。圖13顯示的系統(tǒng)阻抗幅值增益、帶寬以及下降斜率清晰地表明了基于阻抗測試下細(xì)胞阻抗幅值變化的情況。圖12(b)表明系統(tǒng)阻抗角曲線出現(xiàn)一個(gè)波谷，對(duì)于細(xì)胞間電阻的增加，波谷幅值增大，表明細(xì)胞間電阻增大會(huì)使系統(tǒng)呈現(xiàn)向電容特性轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)(最大阻抗角超過-60°)，并且大的細(xì)胞間電阻使得能夠在更小的頻率下顯示更強(qiáng)的電容特性。研究結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)部電學(xué)特性耦合作用導(dǎo)致的系統(tǒng)阻抗變化與細(xì)胞增殖等生理過程的變化同步，可為細(xì)胞實(shí)時(shí)狀態(tài)監(jiān)測提供有效的手段。

圖12 細(xì)胞間電阻對(duì)系統(tǒng)整體阻抗幅頻和相頻特性的影響

圖13 細(xì)胞間電阻對(duì)于系統(tǒng)阻抗幅值低頻增益、帶寬以及下降斜率變化的影響

2.5 細(xì)胞與電極之間電阻的影響

圖14 細(xì)胞電極間電阻對(duì)系統(tǒng)整體阻抗幅頻和相頻特性的影響

3 結(jié)論

細(xì)胞阻抗與細(xì)胞生理/病理狀態(tài)緊密相關(guān)。本文通過建立基于全細(xì)胞RC電路的細(xì)胞阻抗響應(yīng)模型來分析細(xì)胞內(nèi)部各結(jié)構(gòu)的電學(xué)特性變化導(dǎo)致系統(tǒng)總體阻抗變化的原因。模型中考慮了細(xì)胞外液、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核以及細(xì)胞間以及細(xì)胞電極間電學(xué)特性對(duì)于系統(tǒng)阻抗的影響。結(jié)果表明，系統(tǒng)阻抗幅值隨著頻率的增加而降低，其原因是由于高頻率下電流穿過細(xì)胞膜的比例增加進(jìn)而使得其總體阻抗減小。細(xì)胞膜電容電阻、細(xì)胞間電阻以及細(xì)胞電極間電阻增加會(huì)使得細(xì)胞阻抗幅值低頻增益以及帶寬增加，但是會(huì)使得系統(tǒng)出現(xiàn)向電容特性發(fā)展的趨勢(shì)，并且出現(xiàn)于頻率相關(guān)的波谷。該研究為基于細(xì)胞阻抗傳感器測試的細(xì)胞功能實(shí)時(shí)無損表征提供了深入的理論基礎(chǔ)以及為阻抗測試選擇合適的頻率提供了有效指導(dǎo)。

圖15 細(xì)胞電極間電阻對(duì)于系統(tǒng)阻抗幅值低頻增益、帶寬以及下降斜率變化的影響