發(fā)光細(xì)菌法測(cè)定SO2氣體生物毒性的研究

韓麗君 孫玉娟 楊樹平 邢志賢 趙崢 柳蕊

(河北省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，河北 石家莊 050037)

生物毒性檢測(cè)是利用生物監(jiān)測(cè)環(huán)境和化學(xué)品毒性的技術(shù)。發(fā)光細(xì)菌法環(huán)境毒性檢測(cè)技術(shù)因其靈敏度高、反應(yīng)速度快、相關(guān)性好等原因被廣泛應(yīng)用在環(huán)境監(jiān)測(cè)中，目前主要應(yīng)用于飲用水[1-3]、污水[4]、土壤和沉積物[5,6]等毒性檢測(cè)。盡管生物毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法相對(duì)簡(jiǎn)單，但仍存在很多局限性，如充廢氣的快慢、與菌液接觸時(shí)間長(zhǎng)短、充廢氣的量等因素都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響，所以發(fā)光細(xì)菌比較少的運(yùn)用在大氣污染毒性檢測(cè)中[5]。

本次研究以SO2為標(biāo)準(zhǔn)毒性氣體，通過(guò)向青?；【鷳腋∫褐型ㄈ氩煌瑵舛鹊腟O2標(biāo)氣，然后分別測(cè)定菌液發(fā)光強(qiáng)度，以發(fā)光抑制率表征氣體的生物綜合毒性。通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，建立了系統(tǒng)的氣體生物綜合毒性測(cè)試方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，可以通過(guò)優(yōu)化曝氣設(shè)備的精密性來(lái)提高監(jiān)測(cè)的靈敏度和精密度，具有較好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 供試材料

青?；【鶴67凍干粉劑(配有復(fù)蘇稀釋液和滲透壓調(diào)節(jié)液)；

發(fā)光菌凍干粉復(fù)蘇液；

滲透壓調(diào)節(jié)液；

超純水；

500ppm(20℃、108.8kPa 條件下折算濃度為1429mg/m3)SO2標(biāo)準(zhǔn)氣體，純凈空氣做填充氣；

緩沖溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

毒性分析儀： ToxScreen-III；

采樣泵(BDQ-3000，量程0.1～3L/min)、曝氣泵(TWA-300T，量程0.02～0.5L/min)；

移液槍：100μL、1mL、2mL；

燒杯：100mL；

測(cè)試管：5mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法和步驟

1.3.1 SO2標(biāo)氣制備

用Entech4600型動(dòng)態(tài)稀釋儀和純凈空氣將SO2標(biāo)準(zhǔn)氣體稀釋成濃度分別為28.6(10)、57.1(20)、85.7(30)、114.3(40)、142.9 (50)mg/m3(ppm)的SO2系列標(biāo)氣。

1.3.2 發(fā)光菌液復(fù)蘇

取1支青?；【鶴67凍干粉置于室溫(20±1°C左右)平衡15min；

取0.5mL復(fù)蘇稀釋液加入到平衡后的青?；【鶴67凍干粉試劑瓶中；

溶解后的凍干粉溶液置于室溫下復(fù)蘇10min后備用。

1.3.3 曝氣

取2組干凈的5mL測(cè)試管，分別加入2mL滲透壓調(diào)節(jié)液和50μL復(fù)蘇菌液，震蕩混勻。立即向其中1組測(cè)試管中通入系列濃度的SO2標(biāo)氣，測(cè)定其最終發(fā)光值I；同時(shí)向另一組測(cè)試管中加入0.05mL凍干粉溶液，震蕩混勻，通入等時(shí)間、等流量的純凈空氣，測(cè)定最終發(fā)光值I0，作為空白對(duì)照組。

1.3.4 曝氣時(shí)間選擇

按照1.3.3方法以114.3mg/m3的SO2為受試氣體依次測(cè)定不同曝氣時(shí)間梯度的發(fā)光菌液發(fā)光值，從而選擇合適的曝氣時(shí)間。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按照1.3.3方法依次測(cè)定曝入系列SO2標(biāo)氣(1.3.1)的發(fā)光菌液發(fā)光值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程。

1.3.6 計(jì)算發(fā)光抑制率公式

E =(I - I/I0)×100%

式中，E為發(fā)光抑制率；I為發(fā)光強(qiáng)度；I0為空白發(fā)光強(qiáng)度對(duì)照值。

2 結(jié)果與分析

本次實(shí)驗(yàn)的影響因素主要包括實(shí)驗(yàn)溫度、菌液活性、曝氣流量、曝氣時(shí)間等。實(shí)驗(yàn)室溫度和菌液活性影響因素已有比較充分的研究[7-9]，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要保持室溫20±1℃，且所有測(cè)試器皿、試劑及溶液測(cè)試前1h均置于控溫的測(cè)試室內(nèi)。本次研究不再做進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.1 曝氣流量選擇

向待測(cè)菌液中通入SO2標(biāo)氣時(shí)，要考慮氣體的流量，防止流速過(guò)快從而溢出測(cè)試管，還要保證氣體與菌液能充分接觸，有足夠的氧氣供應(yīng)。實(shí)驗(yàn)表明，曝氣流量越大，發(fā)光抑制率越大。由于發(fā)光菌液曝氣時(shí)會(huì)產(chǎn)生泡沫，流量過(guò)大會(huì)導(dǎo)致菌液溢出而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，本次實(shí)驗(yàn)的曝氣流量選擇菌液不會(huì)溢出最大流量0.02L/min。

2.2 曝氣時(shí)間優(yōu)化

向1組配置好的待測(cè)菌液中依次通入濃度為114.3mg/L的SO2標(biāo)氣，曝氣時(shí)間分別設(shè)置為2、3、4、5、6min，分別測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度并計(jì)算相應(yīng)的發(fā)光抑制率E。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，曝氣時(shí)間和發(fā)光抑制率呈指數(shù)上升關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.91，即曝氣時(shí)間越長(zhǎng)靈敏度越高，詳見圖1。但是，曝氣時(shí)間越長(zhǎng)空白菌液發(fā)光值也越高，增大了實(shí)驗(yàn)誤差，綜合考慮以上2方面因素，以下實(shí)驗(yàn)均將曝氣時(shí)間定為5min。

圖1 青?；【鶴67發(fā)光抑制率與SO2曝氣時(shí)間關(guān)系

2.3 發(fā)光抑制率與SO2濃度的效應(yīng)關(guān)系

根據(jù)以上優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，在室溫20℃下，向1組配置好的待測(cè)菌液中依次通入不同濃度的SO2標(biāo)氣，SO2標(biāo)氣濃度分別設(shè)置為28.6、57.1、85.7、114.3、142.9mg/m3，曝氣流量設(shè)置為0.02L/min，曝氣時(shí)間設(shè)置為5min，測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度并計(jì)算發(fā)光抑制率E。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，青?；【鶴67的發(fā)光抑制率與SO2標(biāo)氣濃度呈指數(shù)相關(guān)，Lg(100E)與SO2標(biāo)氣濃度線性相關(guān)(R2=0.96)，詳見圖2、圖3。

圖2 青海弧菌Q67的發(fā)光抑制率(E)

圖3 青?；【鶴67的Lg(100E)與SO2標(biāo)氣濃度關(guān)系

2.4 實(shí)驗(yàn)精密度

本次研究選擇抑制率分別接近90%、50%、10%(實(shí)測(cè)結(jié)果分別為99.6%、54.3%、11.1%)的樣品代表高、中、低抑制率分別進(jìn)行精密度測(cè)試。每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5.2%、20.6%、10.3%。高抑制率和低抑制率3次重復(fù)測(cè)定結(jié)果的相對(duì)偏差均小于發(fā)光細(xì)菌在水質(zhì)中急性毒性測(cè)定的最低精密度要求15%[10]，中抑制率樣品測(cè)定精密度較低(20.6%)。

與發(fā)光菌法測(cè)定水質(zhì)生物綜合毒性相比，氣體毒性實(shí)驗(yàn)增加了曝氣過(guò)程，所以誤差較大。氣流量的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性是影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度的重要因素。實(shí)驗(yàn)裝置的氣密性可通過(guò)裝置的改進(jìn)優(yōu)化方式解決。

2.5 方法檢出限

由圖2曲線可以計(jì)算出發(fā)光抑制率為90%、50%、10%所對(duì)應(yīng)的SO2的濃度分別為143mg/m3(全有效濃度界限值)、112mg/m3(半數(shù)效濃度)、25.4mg/m3(無(wú)效濃度界限值)。當(dāng)抑制率為10%時(shí)，測(cè)試的SO2濃度為25.4mg/m3，可做為本實(shí)驗(yàn)的方法檢出限。該檢出限低于國(guó)家大氣污染物排放標(biāo)準(zhǔn)(GB13271-2014)中SO2最嚴(yán)限值(50mg/m3)。同時(shí)，發(fā)光菌法毒性測(cè)試的LC50(112mg/m3)值也遠(yuǎn)低于小鼠毒性值(6600mg/m3)。因此，該方法具有很好的靈敏度和實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SO2對(duì)青?；【陌l(fā)光性有明顯抑制作用，且發(fā)光抑制率和SO2濃度有顯著的相關(guān)性，可以據(jù)此相關(guān)性定量測(cè)定空氣中SO2的生物毒性；相較于傳統(tǒng)的生物監(jiān)測(cè)用動(dòng)物(如老鼠)作為受試對(duì)象，用發(fā)光細(xì)菌來(lái)測(cè)定氣態(tài)生物綜合毒性的方法簡(jiǎn)單、快速且檢出限低，能夠更好地應(yīng)用到實(shí)際的環(huán)境監(jiān)測(cè)當(dāng)中；與水質(zhì)生物綜合毒性測(cè)試方法相比增加了待測(cè)氣體的曝氣過(guò)程導(dǎo)致精密度較差，需進(jìn)一步提高曝氣設(shè)備的精密度和自動(dòng)化水平。