楊燕飛 顧媛 劉源 竇金鳳
【摘?要】?目的:建立同時(shí)測(cè)定蟬花中肌苷、尿苷含量的方法。方法:采用Shim-pack XP-ODSⅢ(1.6μm,75mm×2.0mm)為色譜柱,甲醇-水 (5∶95) 流動(dòng)相,流速:0.2mL·min-1,柱溫:40℃,進(jìn)樣量:1μL,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)和電噴霧離子化(ESI+)。結(jié)果:肌苷和尿苷分別在2.04~13.60ng·mL-1、15.72~104.80ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2>0.99)。肌苷和尿苷的平均回收率分別為90.58%、91.72%。結(jié)論:該方法具有測(cè)定快速、選擇性好、靈敏高的特點(diǎn),可用于蟬花的質(zhì)量控制。
【關(guān)鍵詞】?蟬花;肌苷;尿苷;UFLC-MS-MS
【中圖分類號(hào)】R284.2?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517(2020)24-0028-03
Abstract:Objective To o establish an UFLC-MS/MS method for the simultaneous determination of inosine and uridine in Jurong Cordyceps cicadae. Methods Shim-pack XP-ODSⅢ C18 column(2.0mmL.D ×75mm,1.6μm),the methanol and water(5∶95) as mobile phase.The flow rate was 0.2mL·min-1 and the column temperature was 40℃.MS instrument was equipped with positive electrospry ionization mode (ESI+) and multiple reaction monitoring(MRM).Result Inosine and uridine had good linear relationship in the range of 2.04~13.60ng·mL-1 、15.72~104.80ng·mL-1 (R2>0.99). The average recovery rate of Inosine and uridine was 90.58% and 91.72%. Conclusion This method has the characteristics of fast selectivity and high sensitivity, and can be used for quality control of Cordyceps cicadae.
Keywords:Cordyceps cicadae;UFLC-MS/MS;Inosine;Uridine
蟬花別名冠蟬(《綱目》引《禮》注)、蟲花《四川中藥志》、蝘花《新華本草綱要》,為麥角菌科棒束孢屬真菌蟬棒束孢菌的孢梗束、蟲草屬真菌大蟬草的子座及其寄生的蟲體[1]。其味甘、性寒、疏散風(fēng)熱、熄風(fēng)止痙、明目退翳[2]。研究發(fā)現(xiàn),蟬花含有含肝糖、蟲草酸、多種必需氨基酸、D-甘露醇、多種生物堿、麥角甾醇等有效成分。具有調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、增強(qiáng)免疫、抗炎、抗菌等保健和藥用活性[3]。
核苷類成分對(duì)人體免疫、代謝、心血管等有重要生理作用,具有抗菌等活性[4-8],有研究表明尿苷有預(yù)防細(xì)胞損害和肝臟機(jī)能失調(diào)的作用,肌苷有助于受損肝細(xì)胞功能的恢復(fù),促進(jìn)肝細(xì)胞的活化,提高肝臟功能。核苷的測(cè)定方法有薄層色譜法[9]、毛細(xì)管電泳法[10]、高效液相色譜法[11] ,其中以HPLC法較為普遍。目前,蟬花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在浙江、四川等省有收載,內(nèi)容僅包括性狀、鑒別和檢查項(xiàng)。由于鎮(zhèn)江市句容地區(qū)環(huán)境適合蟬花的生長(zhǎng),而江蘇省目前未收載蟬花標(biāo)準(zhǔn),故本文采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(Ultra fast liquid chromatography-mass- mass spectrometry,UFLC-MS-MS)方法對(duì)句容蟬花中核苷類成分肌苷、尿苷進(jìn)行含量測(cè)定,為蟬花的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供方法和依據(jù),對(duì)句容蟬花進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。
1?儀器與試藥
1.1?儀器?Shimadzu LC-MS-MS-8050(日本島津,含LC-30AD二元高壓泵, DGU-20A在線脫氣機(jī),CTO-30A柱溫箱,SPD-M30A二極管陣列檢測(cè)器,三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀;CPA225D電子天平(賽多利斯公司,精度為0.01mg)。
1.2?試藥?肌苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院 批號(hào)140669-201606,98.6%),尿苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院 批號(hào)110887-201803,99.5%),甲醇為質(zhì)譜純,水為Milli-Q超純水。6批蟬花均采收于句容茅山,由江蘇大學(xué)藥學(xué)院歐陽臻教授鑒定為Cordyceps cicadae。
2?方法與結(jié)果
2.1?溶液的制備
2.1.1?對(duì)照品溶液的制備?對(duì)照品溶液的制備 分別精取肌苷13.79mg、尿苷10.53mg,加水溶解稀釋至100mL容量瓶中,作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。
2.1.2?供試品溶液的制備?取樣品約0.10g(過四號(hào)篩),置50mL量瓶中,加水40mL超聲30min,定容至刻度,搖勻,濾過,精取續(xù)濾液1mL,稀釋至50mL容量瓶中,作為供試品溶液。
2.2?分析條件
2.2.1?色譜條件?Shim-pack XP-ODSⅢ(2.0mmI.D×75mm,1.6μm)為色譜柱;流動(dòng)相:水-甲醇(95∶5),柱溫:40℃,流速:0.2mL·min-1,進(jìn)樣量:1μL。
2.2.2?質(zhì)譜檢測(cè)條件?離子化模式:電噴霧離子化(ESI),正離子模式;掃描模式:多反應(yīng)檢測(cè)(MRM);離子噴霧電壓:+4.0KV;ESI源溫度:300℃;脫溶劑溫度:250℃;加熱塊溫度:400℃;霧化氣流速:氮?dú)猓?.0L·min-1;干燥氣流速:氮?dú)猓?0.00L·min-1;碰撞氣:氬氣。MRM優(yōu)化參數(shù)見表1,圖譜如圖1、2、3所示。
2.3?方法學(xué)考察
2.3.1?標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備?分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,稀釋成含肌苷2.04ng·mL-1、4.08ng·mL-1、5.44ng·mL-1、6.80ng·mL-1、9.52ng·mL-1、13.60ng·mL-1和尿苷15.72ng·mL-1、31.44ng·mL-1、41.92ng·mL-1、52.40ng·mL-1、73.36ng·mL-1、104.80ng·mL-1的混合對(duì)照品溶液。分別進(jìn)樣,以峰面積與濃度計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。肌苷的回歸方程為Y=2.53207×103X+180.804,R2=0.9941,尿苷的回歸方程為Y=324.641X+2496.57,R2=0.9969。肌苷和尿苷的濃度線性范圍分別在2.04~13.60ng·mL-1和15.72~104.80ng·mL-1時(shí),線性關(guān)系良好。
2.3.2?精密度試驗(yàn)?精取肌苷和尿苷濃度分別為6.80ng·mL-1和41.92ng·mL-1的對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次,肌苷和尿苷峰面積的RSD分別為2.73%和2.79%,精密度良好。
2.3.3?重復(fù)性試驗(yàn)?取樣品0.10g,按“2.1.2”供試品溶液制備方法平行提取樣品6份,按UFLC-MS-MS方法測(cè)定面積。結(jié)果尿苷的平均含量為1227.7μg·g-1,肌苷的平均含量為72.94μg·g-1,RSD分別為2.82%、3.45%。
2.3.4?檢測(cè)限和定量限?取尿苷和肌苷對(duì)照品儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋,至信噪比(S/N)為3和10。此時(shí)尿苷的檢測(cè)限為1.05ng·mL-1,定量限為4.51ng·mL-1;肌苷的檢測(cè)限為0.47ng·mL-1,定量限為1.36ng·mL-1。
2.3.5?穩(wěn)定性試驗(yàn)?取供試品溶液,分別于0、2、4、8h進(jìn)樣測(cè)定,尿苷和肌苷峰面積RSD分別為1.63%,1.49%。結(jié)果供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。
2.3.6?回收率試驗(yàn)?取6份已測(cè)含量的蟬花,分別精密加入尿苷和肌苷對(duì)照品溶液,按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,測(cè)定峰面積計(jì)算回收率。結(jié)果尿苷和肌苷的平均回收率分別為91.72%,90.58%,RSD為2.42%、3.70%,表明該試驗(yàn)方法可靠。見表2。
2.4?樣品測(cè)定?取6批蟬花粉末0.1g(過四號(hào)篩),按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,根據(jù)回歸方程計(jì)算供試樣品的含量。結(jié)果見表3。
3?討論
本實(shí)驗(yàn)對(duì)提取方法進(jìn)行考察,考察溶劑(水、50%甲醇、甲醇),提取時(shí)間(10min、30min、60min)結(jié)果選用溶劑水超聲提取30min,具有操作簡(jiǎn)單、含量提取充分。
比較不同的流動(dòng)相組成(甲醇-水、0.1%甲酸水-甲醇、乙腈-水),實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示以甲醇-水為流動(dòng)相洗脫時(shí),分離時(shí)間短,峰形對(duì)稱,檢測(cè)靈敏度高。
本實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法經(jīng)各項(xiàng)考察,結(jié)果表明方法簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確,重現(xiàn)性好,能同時(shí)測(cè)定2種核苷類物質(zhì),可為準(zhǔn)確測(cè)定蟬花中更多核苷類有效成分提供基礎(chǔ)。
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(收稿日期:2020-07-03?編輯:程鵬飛)