天麻提取物抗帕金森病作用的實(shí)驗研究

陳子方 沈凡藝 李江蕊 茍向薇 郭沛鑫

【摘 要】 目的：研究天麻提取物對帕金森病大鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙的改善作用。方法：采用兩點(diǎn)法于中腦腹側(cè)被蓋部和黑質(zhì)致密部注射6-羥基多巴胺（6-OHDA）復(fù)制大鼠帕金森病模型。灌胃給予天麻提取物，每日1次，連續(xù)21 d。以鹽酸去水嗎啡腹腔注射誘導(dǎo)大鼠旋轉(zhuǎn)，觀察注射5min后30min內(nèi)大鼠恒定向健側(cè)旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)圈數(shù);以Morris水迷宮實(shí)驗觀察大鼠在平臺所在象限的距離百分比（PT%）和停留時間百分比（T%），共同評價天麻提取物對帕金森病大鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙的改善作用。結(jié)果：與模型對照組比較，天麻提取物低劑量組（5 g生藥/kg）、中劑量組（10 g生藥/kg）和高劑量組（20 g生藥/kg）有降低去水嗎啡所誘導(dǎo)的帕金森病大鼠轉(zhuǎn)圈數(shù)的趨勢（P>0.05）;天麻提取物高劑量組（20 g生藥/kg）在水迷宮的平臺象限距離百分比（PT%）和停留時間百分比（T%）明顯增加（P<0.05）。結(jié)論：天麻提取物能明顯改善帕金森病大鼠的神經(jīng)行為學(xué)障礙，顯示出明顯的抗帕金森病的作用。

【關(guān)鍵詞】 天麻提取物;帕金森病;神經(jīng)行為學(xué)障礙;實(shí)驗研究

【中圖分類號】R285.5?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2020）21-0020-04

Experimental Study on the Anti-Parkinsons Effect of Gastrodia Extract

CHEN Zifang Shen Fanyi LI Jiangrui GOU Xiangwei GUO Peixin*

Yunnan University of Chinese Medicine，Kunming 650500，China

Abstract：Objective TO study Gastrodia extract on the anti-parkinsons effect.Methods A two-point method was used to inject 6-hydroxydopamine （6-OHDA） into ventral tegmental area （VTA） and substantia nigra pars compacta （SNc） of rats to copy models of parkinsons disease.Gastrodia extract was given by gavage，once per day，continuously for 21 days.The rat rotation was induced by intraperitoneal injection of 0.5mg/kg apomorphine hydrochloride（APO） ，and the numbers of constant rotation to the healthy side were observed within 30 min after 5 min of injection.Morris water maze experiment was used to observe the percentage of distance （PT%） and the percentage of time （T%） that rats stay in the quadrant where the platform is located.To jointly evaluate the improvement effect of Gastrodia extract on neurobehavioral disorders in parkinsons disease rats.Results Compared with the model group，the low-dose group （5 g crude drug / kg），medium-dose group （10 g crude drug / kg），and high-dose group （20 g crude drug / kg） of Gastrodia extract reduced the number of rotation induced by APO（P>0.05）.The high-dose group of Gastrodia extract（20 g crude drug / kg）? increased significantly PT% and T%（P<0.05）.Conclusion Gastrodia extract can significantly improve the neurobehavioral disorders of parkinsons disease rats，and shows obvious anti-parkinsons effects.

Keywords： Gastrodia Extract;Parkinsons Disease;Neurobehavioral Disorders;Experimental Study

帕金森疾病 （Parkinsons Disease，PD） 是一種復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)于中老年人[1]。主要病因為腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的變性壞死致使多巴胺的含量相對不足，目前發(fā)病機(jī)制尚不明確[2-3]。雖然在PD早期階段有較好的對癥治療方法，但并不能逆轉(zhuǎn)神經(jīng)退行性病變的進(jìn)程[4]。中藥天麻為蘭科天麻屬植物天麻（Gastrodia elata Bl.）的根莖，有息風(fēng)定驚、平肝潛陽等功效。近年來，關(guān)于天麻抗PD的研究報道較多[5-6]，但其有效成份尚不明確。本實(shí)驗通過提取天麻成分，觀察天麻提取物對PD大鼠的治療作用，以期闡明中醫(yī)對于天麻善于“息風(fēng)定驚”的科學(xué)內(nèi)涵，明確其有效部位，為指導(dǎo)天麻治療PD的臨床合理用藥和開發(fā)新藥提供實(shí)驗依據(jù)。

1 實(shí)驗材料

1.1 藥物 天麻提取物，由本實(shí)驗室自制（制法：用搖擺式中藥粉碎機(jī)將天麻打粉至粗粉，用電子稱稱取天麻粗粉放入圓底燒瓶，分次加入5倍量95%乙醇回流提取3次（2 h∶1 h∶1 h）。合并3次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，將濃縮液加入熱水轉(zhuǎn)移，按照提取液：乙酸乙酯1∶1.5的比例加入乙酸乙酯萃取四次，合并下層水液，加熱濃縮，然后將濃縮液轉(zhuǎn)移至恒溫水浴鍋揮至浸膏狀，放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中繼續(xù)干燥至恒重，即得）。美多芭（批號：SH2061，由上海羅氏制藥有限公司）。

1.2 動物 SD大鼠，雄性，清潔級，體重250～350 g，由四川醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗動物研究所提供，動物合格證號：SCXK（川）2013-12。

1.3 試劑 6-羥基多巴胺（6-OHDA，批號：MKBX2602V，Aldrich公司）;阿撲嗎啡（Apomorphine，批號：LKF0204，Wako公司）。其余試劑均為分析純。

1.4 儀器 51500腦立體定位儀（Stoelting 公司）;BW-MIP906型微量注射泵（上海軟隆科技有限公司）;BW-SHD908型高速顱骨鉆（上海軟隆科技有限公司）;cence L 500臺式高速冷凍離心機(jī)（Thermo Scientific）;101-OAB烘箱（天津市泰斯特儀器有限公司）;UXF30086V63冰箱（海爾公司）。

2 方法

2.1 帕金森病大鼠模型的復(fù)制 將大鼠用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射進(jìn)行麻醉，俯臥位固定于腦立體定位儀上，門齒低于耳桿2.3 mm，根據(jù)Paxson《The Rat Brain》圖譜，用6-OHDA行腦立體定位注射，制作PD大鼠模型。用0.2%抗壞血酸配制6-OHDA溶液（濃度：5 μg/μL），將上述溶液分別注入右側(cè)黑質(zhì)致密部（SNc，坐標(biāo)為AP=-4.8 mm，ML=-1.2 mm，DV=-8.2 mm）和中腦腹側(cè)被蓋部（VTA，坐標(biāo)為AP=-4.8 mm，ML=-2.0 mm，DV=-8.0 mm）各4 μL，留針5 min，緩慢退針。傷口處涂抹硫酸慶大霉素，用人工骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合頭皮。造模14 d后，腹腔注射阿撲嗎啡（0.5 mg/kg）誘導(dǎo)大鼠向健側(cè)轉(zhuǎn)圈，選取平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)≥7 r/min的大鼠作為造模成功大鼠[7]。

2.2 分組及給藥 取PD模型復(fù)制成功的大鼠隨機(jī)分為模型對照組（給予等體積蒸餾水）、美多芭組（7.8 mg/kg）、天麻提取物低劑量組（5 g生藥/kg）、中劑量組（10 g生藥/kg）、高劑量組（20 g生藥/kg），每組8只。于每天早上8點(diǎn)按上述劑量定時灌胃給藥，灌胃體積為1 mL/100 g，連續(xù)灌胃給藥21 d。

2.3 行為學(xué)檢測

2.3.1 對阿樸嗎啡所誘導(dǎo)的PD大鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙的影響 在給藥期間，每7 d進(jìn)行1次行為學(xué)檢測，腹腔注射阿撲嗎啡（0.5 mg/kg）誘導(dǎo)大鼠轉(zhuǎn)圈，觀察其行為學(xué)變化，記錄注射5 min后30 min內(nèi)各組大鼠恒定向健側(cè)旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)圈數(shù)，以此評價藥物對大鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙的改善作用[8]。

2.3.2 水迷宮實(shí)驗[9] Morris水迷宮為直徑1.2 m，高0.9 m的圓形水池，水池內(nèi)壁被漆為黑色，池內(nèi)水深0.5 m，水溫保持在（22±2） ℃，房間內(nèi)光照恒定，無光線直射在水池內(nèi)。池壁上以4個等距離點(diǎn)將水池分為4個象限，在目標(biāo)象限（設(shè)為3象限）內(nèi)距離池壁35 cm處放有直徑為10 cm高23 cm的圓形黑色站臺，站臺位于水面下2 cm。池壁內(nèi)側(cè)貼有不同形狀的標(biāo)記物。迷宮上方安置連接顯示系統(tǒng)的攝像機(jī) ，同步記錄大鼠運(yùn)動軌跡。采用Smart2.0 Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)進(jìn)行信息處理。

2.3.2.1 記憶訓(xùn)練期（第1～2 d） 將大鼠面朝池壁放入水中游泳60 s，第1天引導(dǎo)其登上平臺，第2天若在60 s內(nèi)動物沒有登上平臺則繼續(xù)引導(dǎo)其登上平臺，停留15 s后放入溫暖干燥的籠子結(jié)束訓(xùn)練。

2.3.2.2 記憶增強(qiáng)期（第3～5 d） 每只動物每天早晚各1次實(shí)驗，每次分別從除平臺所在方位外的3個方位各放1次，每只動物放入水中的間隔時間為15 s。動物單次游泳時間為60 s，若大鼠在60 s內(nèi)不能上臺則引導(dǎo)其登上平臺適應(yīng)15 s后進(jìn)行下1次實(shí)驗。最后將大鼠擦干放入鼠籠。

2.3.2.3 空間探索實(shí)驗（第6 d） 撤除平臺，將大鼠從與平臺相對的方位面朝池壁放入水中，讓大鼠自由游泳60 s后將動物擦干放入鼠籠。觀察大鼠在平臺所在象限的距離百分比（PT%）和停留時間百分比（T%），以此來評價藥物對大鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙的影響（PT%和T%值越大，表明大鼠的認(rèn)知記憶能力越強(qiáng)）。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 各組數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（x±s）表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，多組間兩兩比較采用one-way ANOVA，方差齊時采用LSD法，方差不齊時采用Tamhanes T2法。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對阿樸嗎啡所誘導(dǎo)的PD大鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙的影響 實(shí)驗結(jié)果表明，連續(xù)給藥7 d和14 d，天麻提取物各劑量組大鼠轉(zhuǎn)圈數(shù)與模型對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;連續(xù)給藥21 d，天麻提取物低劑量組（5 g生藥/kg）、中劑量組（10 g生藥/kg）和高劑量組（20 g生藥/kg）有降低阿樸嗎啡所誘導(dǎo)的PD大鼠轉(zhuǎn)圈數(shù)的趨勢，但與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。上述結(jié)果可能與PD大鼠受損側(cè)腦區(qū)多巴胺受體的緩慢恢復(fù)有關(guān)。結(jié)果見表1、圖1。

3.2 水迷宮實(shí)驗 實(shí)驗結(jié)果表明，與模型對照組比較，天麻提取物高劑量組（20 g生藥/kg）在水迷宮的平臺象限距離百分比（PT%）和停留時間百分比（T%）明顯增加，組間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。天麻提取物低劑量組（5 g生藥/kg）和中劑量組（10 g生藥/kg）也能增加大鼠在水迷宮的平臺象限距離百分比（PT%）和停留時間百分比（T%），但與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表2、圖2。

4 討論

PD患者常伴隨著神經(jīng)行為學(xué)障礙的發(fā)生，改善神經(jīng)行為學(xué)障礙，使患者回歸社會，是藥物治療的重要目的[10]。在本次實(shí)驗里，選擇了鹽酸去水嗎啡（APO）所誘導(dǎo)的PD大鼠旋轉(zhuǎn)實(shí)驗和水迷宮實(shí)驗來評價天麻提取物抗PD的作用。首先，在APO誘發(fā)PD大鼠旋轉(zhuǎn)的實(shí)驗中，實(shí)驗利用立體定位儀，參考大鼠的大腦立體圖譜，將6-OHDA定位注射到大鼠右側(cè)黑質(zhì)致密部和中腦腹側(cè)被蓋部，破壞黑質(zhì)-紋狀體DA系統(tǒng)，使動物毀損側(cè)多巴胺能神經(jīng)元缺失、受損，導(dǎo)致多巴胺含量降低，表現(xiàn)為PD樣的癥狀[11-12]。此時，機(jī)體在受體調(diào)節(jié)機(jī)制下，受損側(cè)D2受體出現(xiàn)上調(diào)，產(chǎn)生超敏感現(xiàn)象，當(dāng)給予APO激動D2受體后則產(chǎn)生比健側(cè)更強(qiáng)的DA活性，故而表現(xiàn)為向健側(cè)的旋轉(zhuǎn)。給藥后，藥物對腦內(nèi)神經(jīng)元起到保護(hù)作用，受損側(cè)腦區(qū)受體超敏現(xiàn)象得到改善，但此種改善是一個緩慢的過程，所以實(shí)驗僅在給藥21d后觀察到大鼠的轉(zhuǎn)圈數(shù)有下降的趨勢。在Morris水迷宮實(shí)驗中，大鼠在目標(biāo)象限的距離百分比（PT%）和停留時間百分比（T%）數(shù)值越大，說明其空間學(xué)習(xí)記憶能力越好[13]。實(shí)驗結(jié)果表明，天麻提取物高劑量（20 g生藥/kg）能明顯增加PD大鼠在目標(biāo)象限的距離百分比（PT%）和停留時間百分比（T%）（P<0.05）。

綜上，天麻提取物口服給藥，能增強(qiáng)PD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，明顯改善神經(jīng)行為學(xué)障礙，但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]彭喬君，王玉鳳，劉新，等.帕金森病非運(yùn)動癥狀腦功能網(wǎng)絡(luò)特征及其調(diào)控研究進(jìn)展 [J].中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2020，27（5）：407-411.

[2]PALMISANO C，BRANDT G，VISSANI M，et al.Gait Initiation in Parkinsons Disease：Impact of Dopamine Depletion and Initial Stance Condition [J].Front Bioeng Biotechnol，2020（8）：137.

[3]MARCHETTI B，TIROLO C，L′EPISCOPO F，et al.Parkinsons disease，aging and adult neurogenesis：Wnt/β-catenin signalling as the key to unlock the mystery of endogenous brain repair [J].Aging Cell，2020，19（3）：e13101.

[4]丁婧，趙琳琳，曲揚(yáng)，等.神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病基因治療的研究進(jìn)展 [J].中國免疫學(xué)雜志，2020，36（14）：1791-1794.

[5]YAN J，YANG Z，ZHAO N，et al.Gastrodin protects dopaminergic neurons via insulin-like pathway in a Parkinsons disease model [J].BMC Neurosci，2019，20（1）：31.

[6]張大燕，文歡，王偉，等.天麻對帕金森小鼠神經(jīng)元保護(hù)作用機(jī)制的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析[J].中國實(shí)驗方劑學(xué)雜志，2018，24（16）：73-81.

[7]謝金鹿，耿希文，何婷婷，等.高效帕金森病大鼠模型建立方法的研究[J].濟(jì)南大學(xué)學(xué)報，2017，31（2）：159-163.

[8]陳曦，趙姝馨，吳開杰，等.采用深度學(xué)習(xí)法檢測6-OHDA帕金森病大鼠模型黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元[J].中國新藥雜志，2019，28（7）：849-855.

[9]王思夷，肖瑤，李俊，等.鹽酸多奈哌齊對帕金森大鼠認(rèn)知功能及大腦海馬組織Klotho、Akt和Foxo3a表達(dá)的影響[J].毒理學(xué)雜志，2019，33（3）：178-182，188.

[10]HUANG X，STERLING N W，DU G，et al.Brain cholesterol metabolism and Parkinsons disease [J].Mov Disord，2019，34（3）：386-395.

[11]CASTELLI V，DANGELO M，LOMBARDI F，et al.Effects of the probiotic formulation SLAB51 in in vitro and in vivo Parkinsons disease models.[J].Aging （Albany NY），2020，12（5）：4641-4659.

[12]LAFUENTE J V，REQUEJO C，UGEDO L.Nanodelivery of therapeutic agents in Parkinsons disease [J].Prog Brain Res，2019（245）：263-279.

[13]NUNEZ J.Morris Water Maze Experiment [J].J Vis Exp，2008，（19）：897.

（收稿日期：2020-06-15 編輯：劉 斌）

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助（NO.81660671）;云南省科學(xué)技術(shù)廳-云南中醫(yī)藥大學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項資助（NO.2017FF116（-010））;國家重點(diǎn)研發(fā)計劃中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)專項資助（NO.2017YFC1703901） 。

作者簡介：陳子方（1996-），女，回族，碩士研究生在讀，研究方向為民族藥。E-mail：2248183463@qq.com

通信作者：郭沛鑫（1976-），男，漢族，博士，副教授，研究方向為中藥及民族藥研究。E-mail：peixin-guo@163.com