昭通市5縣區(qū)花魔芋蛋白質含量的測定

李 浪，張澤俊，張正彪，范賢林

（昭通學院 化學化工學院，云南 昭通 657000）

1 前言

魔芋（Konjac，為天南星科魔芋屬多年生宿根性草本耐陰植物的地下塊蓮，學名為藤龍，又名鬼芋、花桿蓮、天南星等，中藥稱蛇六谷）[1]。有學名的魔芋屬種已有170 多種，塊莖呈扁圓型、葉柄呈圓柱形、掌狀復葉呈淡綠色多帶有暗紫色斑點，株高40 至70 公分，生長于疏林下，開紫紅色花，最早發(fā)現于斯里蘭卡和印度。我國早在一千多年前就已經開始種植，在晉朝的《蜀都賦》中就有詳細記載[2]。現主要生長在我國湖北、云南、四川等地，是我國的一種古典醫(yī)藥[3]。魔芋是一種藥食兩用的多年生草本植物，果實中含大量的葡甘聚糖及豐富的生物堿、黃酮、淀粉、神經酰胺、纖維素和礦物質等多種功能性成分，均具有明顯的生物活性。魔芋果實具有多種特性其中包括高纖維、低蛋白、低脂肪、膨脹率高等，其藥用功效方面還具有降三高、抗氧化、保健美容、抗癌解毒等多種療效[4-6]，具有廣闊的市場前景。

魔芋中的蛋白質是人體極為重要的營養(yǎng)物質，是生物體細胞組織構成的重要成分之一。蛋白質與人體的營養(yǎng)代謝、氧氣運輸、信息交流、細胞結構、增強免疫和遺傳物質等相關[7]，具有構成機體、修復組織、構成酶和激素等活性物質、供給機體能量等生理功能，也是人體中氮的唯一來源，具有糖類和脂肪不可替代的作用[8]。目前而言，國內對昭通魔芋中各種有效成分提取分離所得的產品純度還不高，使得魔芋的利用率不高造成資源浪費，沒有實現真正意義上的綜合利用。測定蛋白質含量的方法有經典的方法和先進的方法，其中經典的方法包括雙縮脲試劑法、Folin-酚試劑法、紫外吸收測定法、考馬斯亮藍法等；先進的方法包括近紅外光譜(Near Infrared Espectroscopy，簡稱NIR)分析技術、膠體金染色法、杜馬斯燃燒法、流動注射分析法等[9]。雙縮脲試劑法本身具有試劑單一、干擾物質較少、呈色性好、操作簡單、準確性高等優(yōu)點[10]，但靈敏度低需要把樣品稀釋至蛋白質濃度為1～10 mg/mL，這時測定結果較準確，所以本實驗采用雙縮脲試劑法作為首選測定方法[11,12]。本實驗對昭通市5 個不同地區(qū)花魔芋中蛋白質含量測定的研究，為魔芋產品的附加值提供有價值的實驗數據。

2 實驗部分

2.1 實驗材料

實驗所用的花魔芋采自昭陽區(qū)、彝良縣、大關縣、鎮(zhèn)雄縣、永善縣5 個地區(qū)。將花魔芋洗凈后切片，置于40℃烘箱烘干，烘干后的魔芋經粉碎機粉碎后置于60 目，制得魔芋干粉，并于清潔干燥處放置，備用。

2.2 實驗儀器設備與主要試劑

2.2.1 儀器設備

DFT-250A 手提式高速萬能粉碎機（浙江溫嶺市林大機械有限公司）、EP64C 專業(yè)型分析天平（0.0001 g）（美國奧豪斯國際貿易有限公司）、HH-S24 數顯恒溫水浴鍋（常州市金壇友聯儀器研究所）、721 型可見分光光度計（山東高密彩虹分析儀器有限公司）、800 型離心沉淀器（上海手術器械廠）、DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海-恒科技有限公司）。

2.2.2 試劑

四氯化碳（天津市風船化學試劑科技有限公司）、酒石酸甲鈉（成都化學試劑廠）、硫酸銅（天津市風船化學試劑科技有限公司）、碘化鉀（廣東光華化學廠有限公司）、氫氧化鈉（天津市風船化學試劑科技有限公司）、牛血清蛋白（美侖生物化學試劑科技有限公司）以上藥品均是分析純。

雙縮脲試劑A 液配制：將0.1250 mol 氫氧化鈉放入100 mL 燒杯中溶解移入250 mL 容量瓶中定容，得0.5 mol/L 氫氧化鈉溶液。B 液配制：將0.004 mol 硫酸銅（1 g）、0.0040 mol 碘化鉀和2.5000 g 酒石酸甲鈉依次加入100 mL 燒杯中溶解后移入250 mL 容量瓶中定容，得0.0160 mol/L 硫酸銅溶液。

0.0500 mol/L 氫氧化鈉溶液：將0.0500 g 氫氧化鈉放入100 mL 燒杯中溶解移入250 mL 容量瓶中定容備用。

5 mg/mL 的蛋白質標準液：準確稱取0.2500 g牛血清蛋白于燒杯中用0.0500 mol/L 的氫氧化鈉溶液溶解，移入50 mL 容量瓶中用0.0500 mol/L 的氫氧化鈉溶液定容備用。

2.3 實驗方法

在比較紫外吸收測定法、雙縮脲試劑法、考馬斯亮藍法、Folin-酚試劑法四種方法測得蛋白質含量之間差異均不顯著[12]。蛋白質中均含有碳、氫、氧、氮四種元素，其中含量最恒定的為氮元素，占16%左右[13]，蛋白質含有2 個以上肽鍵。在強堿性溶液中發(fā)生雙縮脲反應，與硫酸銅形成紫色絡合物，該絡合物顏色深淺與蛋白質濃度成正比，所以根據氮元素的含量進行推算魔芋中蛋白質的含量。雙縮脲試劑法能夠有效地消除脂肪、糖類等物質的干擾，其精密度與準確度較高，有利于提高實驗效率，值得進一步推廣應用[14]。雙縮脲法測定速度較快(約60 min)、對蛋白質呈色定性好、干擾物少、操作簡便、不必提純蛋白質，但靈敏度低需要把樣品稀釋至蛋白質濃度為1～10 mg/mL，這時測定結果較準確。雙縮脲試劑法利用721 型分光光度計測定吸光度值，可直接測定蛋白質含量[15,16]因此作為本實驗方法。

2.3.1 最大吸收波長

在10 mL 容量瓶中加入2 mL 含量為5 mg/mL的蛋白質標準液，再加入0.5 mL 蒸餾水，用7.5 mL 雙縮脲試劑定容，搖勻靜置5min。然后于721型分光光度計在波長370 至580 nm 下，每間隔10 nm 測定吸光度確定最大吸收波長范圍，再以每間隔2 nm 測定吸光度確定最大吸收波長。以0 mL的標準液2.5 mL 蒸餾水7.5 mL 雙縮脲試劑定容為空白試劑對照比色，多次實驗選用最佳數據確定最大吸收波長。

2.3.2 單因素試驗

為了確定魔芋蛋白質最佳測定工藝條件，研究了四氯化碳的量和測定溫度對魔芋蛋白質的影響作用。

2.3.2.1 四氯化碳量的影響

用制得的魔芋干粉樣品準確稱取相當于25 mg蛋白質樣品，轉入5 個標記好的25 mL 容量瓶中，分別準確加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 四氯化碳，24.5、24、23.5、23.0、22.5 mL 雙縮脲試劑定容。分別劇烈震蕩10min 靜置15min，用4000 r/min 的離心沉淀器離心5min 后取出清液。分別取4 mL清液于10 mL 容量瓶中用雙縮脲試劑定容，以空白試劑對照比色，多次實驗選用最佳數據確定加入四氯化碳的量。

2.3.2.2 溫度的影響

用制得的魔芋干粉樣品準確稱取相當于25 mg 蛋白質樣品轉入錐形瓶，加入0.5 mL 四氯化碳24.5 mL 雙縮脲試劑后放入數顯恒溫水浴鍋中（從20℃至60℃每次升高5℃）劇烈震蕩10min，靜置15min，用4000 r/min 的離心沉淀器離心5min 后取出清液。分別取4 mL 清液于10 mL 容量瓶中用雙縮脲試劑定容，以空白試劑對照比色，做多次實驗選用最佳數據確定實驗溫度。

2.3.3 標準曲線制作方法

以牛血清蛋白制得的含量為5 mg/mL 的蛋白質溶液為標準樣品制作標準曲線，用6 個10mL 的容量瓶做好標記分別加入標準溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，再分別加入2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0 mL 蒸餾水，最后用7.5 mL 雙縮脲試劑定容，搖勻靜置5min 用721 型分光光度計在波長550 nm下以0 mL 的標準液容量瓶為空白對照比色，繪制標準曲線。

2.3.4 樣品蛋白質含量測定

用制得的魔芋干粉樣品準確稱取相當于25 mg蛋白質樣品，分別轉入5 個標記好的25 mL 容量瓶中，加入上述最佳四氯化碳量，用雙縮脲試劑定容。分別劇烈震蕩10min 靜置15min，用4000 r/min 的離心沉淀器離心5min 后取出清液，分別吸取4 mL 清液于10 mL 容量瓶中，按上述標準曲線的測定方法，測定實驗樣品的吸光度值，做三次平行實驗計算樣品中蛋白質的含量。

3 實驗結果與討論

3.1 最大吸收波長結果

按2.3.1 實驗方法用721 型分光光度計在波長370 nm 至580 nm 下測定吸光度，實驗結果表明波長540 nm 至560 nm 有最佳測定波長，實驗結果如表1，由圖1已知在550 nm 處為最佳測定波長。

表1 最大吸收波長結果Tab.1 Maximum absorption wavelength results

圖1 最大吸收波長結果Fig.1 Maximum absorption wavelength result

3.2 標準曲線回歸方程建立

按2.3.3 實驗方法用721 型分光光度計在波長550 nm 下測定吸光度，結果如表2圖2所示，以吸光度為橫坐標，以蛋白質濃度為縱坐標，繪制出標準曲線。圖2標準曲線的方程為：Y=8.29X +0.036，其中牛血清蛋白濃度(X)和吸光度(Y)的相關系數R2=0.9998 方程的線性良好可應用。

表2 標準曲線制作結果Tab.2 Standard curve production results

圖2 標準曲線制作結果Fig.2 Standard curve production results

3.3 單因素試驗結果

3.3.1 四氯化碳量的影響

按2.3.2.1 實驗方法用721 型分光光度計在波長550 nm 下測定吸光度，實驗結果如表3所示，由表已知四氯化碳最佳使用量1.5 mL。

表3 四氯化碳的量結果Tab.3 Results of the amount of carbon tetrachloride

3.3.2 溫度的影響

按2.3.2.2 實驗方法用721 型分光光度計在550 nm 波長、1.5 mL 四氯化碳條件下測定吸光度。如表4所示實驗表明當溫度達到60 ℃時蛋白質失去活性無法測定，溫度在20 ℃至50 ℃范圍雙縮脲法對蛋白質產生的顏色反應影響較小可忽略不計[17]。

表4 溫度的影響結果Tab.4 The effect of temperature

3.4 樣品蛋白質含量測定結果

按2.3.4 實驗方法用721 型分光光度計在波長為550 nm、室溫、1.5 mL 四氯化碳條件下測定，結果顯示：如表5所示不同地區(qū)魔芋中蛋白質的含量不同，昭陽區(qū)（2.04%）＞彝良縣（2.02%）＞大關縣（1.98%）＞鎮(zhèn)雄縣（1.72%）＞永善縣（1.27%）。

表5 樣品測定結果Tab.5 Sample measurement results

3.5 測定方法的檢驗

按標準曲線Y=8.29X + 0.036 回歸方程計算所有的結果。

3.5.1 精密度實驗

精密吸取標準溶液(5 mg/mL)0.5 mL 進行精密度實驗，連續(xù)進行6 次測定其吸光度，如表6所示得RSD=4.6%，結果小于5%，實驗結果表明精密度好。

表6 精密度實驗結果Tab.6 Precision experiment results

3.5.2 穩(wěn)定性實驗

取同一樣品溶液1 mL，每隔10 min 測定1 次，比較穩(wěn)定性，實驗結果如表7所示得RSD=1.2%，由表已知在顯色60 min時間內吸光度穩(wěn)定性較好。

表7 穩(wěn)定性實驗結果Tab.7 Stability experiment results

3.5.3 重現性實驗

精密稱取同一原料樣品，多次配制每次取1 mL 樣品液按樣品測定方法，分別測定其吸光度，檢驗該測定方法的重現性，實驗結果如表8所示得RSD=3.60%，結果小于5%，表明重復性較好。

表8 重現性實驗結果Tab.8 Reproducibility experiment results

3.5.4 回收率實驗

準確吸取已配制的1 mg/mL 樣品溶液1 mL，分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL蛋白質標準溶液，按上述樣品測定方法分別測定其吸光度，計算回收率。實驗結果如表9所示樣品平均回收率均為114.96%，RSD 為4.95%，表明本法可行[18]。

表9 回收率實驗Tab.9 Recovery rate experiment

4 結論

本研究選用昭通市花魔芋資源作為研究對象，對5 個不同地方花魔芋的蛋白質含量進行研究比較，用雙縮脲試劑法對不同地區(qū)魔芋中蛋白質進行含量的測定，結果顯示：不同地區(qū)魔芋中蛋白質的含量不同且昭陽區(qū)（2.04%）＞彝良縣（2.02%）＞大關縣（1.98%）＞鎮(zhèn)雄縣（1.72%）＞永善縣（1.27%）。由實驗已知雙縮脲法在波長為550 nm下測定魔芋蛋白質時，當蛋白質濃度在1～10 mg/mL 范圍內，線性關系比較好，變異系數小，重復性好，平均回收率和精密度都很高。該方法快速、準確、重現性和穩(wěn)定性好，為快速測定植物中蛋白質成分含量提供了重要參考[19]雙縮脲試劑法測定魔芋蛋白質含量所需時間少，操作簡單，對環(huán)境無污染，是一種非常有前途的測定蛋白質的方法[20]。魔芋中蛋白質是人體極為重要的營養(yǎng)物質，是生物體細胞組織構成的重要成分之一。蛋白質含量的多少也是反映食品營養(yǎng)價值和用途的重要指標，同時也決定著食品的商業(yè)價值，因此實現對蛋白質含量的快速準確測定不僅是滿足人們的營養(yǎng)需求，而且在一定程度上保障了消費者的合法權益。但目前由于技術水平的限制，蛋白質檢測儀方法還需要進一步改進。探索藥品儀器測定不同種類蛋白質的原理，實現高速、精確的技術檢測體系，以滿足人們對各種蛋白質的測定。