PCBs和PAHs脅迫下大豆和黃瓜種子萌發(fā)及幼苗生長特征

劉浩然，王俊霞,2,4,*，沈曉芳，顧海東，張占恩,2,4

1. 蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，蘇州 215009 2. 蘇州科技大學(xué)，江蘇省環(huán)境科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘇州 215009 3. 新加坡國立大學(xué)蘇州研究院，蘇州 215024 4. 蘇州科技大學(xué)，水處理技術(shù)與材料協(xié)同創(chuàng)新中心，蘇州 215009

多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)和多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbon, PAHs)是2類常見的持久性有機(jī)污染物(POPs)，因其具有持久性和生物富集性，已在地表水、土壤、地下水、植物和動(dòng)物體內(nèi)廣泛檢出[1-3]。相關(guān)毒理學(xué)數(shù)據(jù)表明，它們具有神經(jīng)毒性、生殖毒性、內(nèi)分泌干擾作用甚至致癌作用。Menzel等[4]發(fā)現(xiàn)PCB-52對(duì)以線蟲為代表的動(dòng)物有明顯的毒害作用，會(huì)引起線蟲的基因響應(yīng)。Wang等[5]檢測了中國東海大黃魚體內(nèi)的PCBs和PAHs濃度，發(fā)現(xiàn)其已達(dá)人體致癌濃度，不僅對(duì)魚類產(chǎn)生嚴(yán)重危害，且通過食物鏈的傳遞和富集最終威脅人體健康。受到PCBs和PAHs污染的地區(qū)，人類罹患癌癥的概率和死亡率數(shù)倍甚至數(shù)十倍高于未被污染的地區(qū)[6]。Zeneli等[7]的研究表明，煉油廠排放的總石油烴(total petroleum hydrocarbons, TPH)和PAHs混合物對(duì)植物有明顯毒害作用，并且植物在混合物暴露時(shí)對(duì)PAHs的吸收率比單一PAHs暴露時(shí)更高。羅春燕等[8]的研究表明，當(dāng)膠體富勒烯和菲共存時(shí)，對(duì)植物的毒性增高，當(dāng)納米富勒烯和菲共存時(shí)，對(duì)植物的毒性降低。目前，國內(nèi)外尚缺乏PCBs和PAHs復(fù)合污染脅迫下植物的生長情況以及植物對(duì)復(fù)合污染物的吸收和富集特征的研究。

黃瓜(CucumissativusL.)是我國重要的蔬菜作物之一，屬于葫蘆科一年生攀援草本植物；大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)是我國重要糧食作物之一，屬于豆科一年生草本農(nóng)作物，不同植物種類對(duì)PCBs和PAHs的脅迫響應(yīng)存在一定差異。種子萌發(fā)及幼苗生長是植物對(duì)環(huán)境脅迫最敏感的時(shí)期。通過種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，在2,4,4’-三氯聯(lián)苯(PCB28)和菲單一脅迫和復(fù)合脅迫下，考察大豆和黃瓜種子發(fā)芽率、幼苗生長狀況和光合作用能力，以及PCB28和菲在植物體內(nèi)的吸收和分布特征，為PCBs和PAHs復(fù)合污染的植物毒性研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為后續(xù)植物修復(fù)技術(shù)研究提供了方向。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黃瓜(滬雜3號(hào))和毛豆(滬寧96-10)種子購于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝研究所。篩選大小均勻、顆粒飽滿的種子用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaClO消毒15 min，用清水洗凈后待用。

1.2 種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)

參照田月娥等[9]的方法完成種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)。將種子浸泡在不同濃度單一PCB28、菲以及復(fù)合PCB28+菲處理組中24 h，之后用蒸餾水洗凈，置于鋪有3層濾紙的培養(yǎng)皿(φ=10 cm)中，每個(gè)培養(yǎng)皿放20粒種子，對(duì)照組以蒸餾水浸種，將培養(yǎng)皿放到人工氣候箱中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度設(shè)定為3 000 lx，光暗周期為12 h/12 h，晝夜溫度為28 ℃/18 ℃，相對(duì)濕度為70%～75%。

種子萌發(fā)期間，每天觀察并記錄發(fā)芽情況。發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)為胚根長度達(dá)到種子長度的1/2，發(fā)芽后測定相對(duì)發(fā)芽率和發(fā)芽勢(5 d)，萌發(fā)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至無新種子萌發(fā)為止。

參考李葉等[10]的研究，設(shè)計(jì)PCB28的低、中、高濃度組(0.01、0.1和1.0 mg·L-1)，分別標(biāo)記為1-T-1、1-T-2和1-T-3，根據(jù)Iqbal等[11]的研究，設(shè)計(jì)菲的低、中、高濃度組(0.01、0.1和1.0 mg·L-1)，分別標(biāo)記為2-T-1、2-T-2和2-T-3，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，標(biāo)記為CK1T。為考察PCB28和菲的聯(lián)合毒性，將0.1 mg·L-1PCB28分別與低、中、高濃度菲(0.01、0.1、1.0 mg·L-1)組成混合暴露組，分別標(biāo)記為3-T-1、3-T-2和3-T-3。暴露0 d時(shí)植物葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)作為對(duì)照組，標(biāo)記為CK2T。

1.3 測定方法

1.3.1 萌發(fā)指標(biāo)

發(fā)芽勢(Gv)=n/N×100%，其中，n為規(guī)定時(shí)間內(nèi)(5 d)發(fā)芽種子數(shù)，N為種子總數(shù)。

發(fā)芽率(Gp)=n1/N1×100%，其中，n1為無新種子萌發(fā)時(shí)的最終發(fā)芽種子數(shù)，N1為無新種子萌發(fā)時(shí)的最終種子總數(shù)。

為排除培養(yǎng)條件如溫度、濕度等自然條件對(duì)種子發(fā)芽的影響，計(jì)算相對(duì)發(fā)芽率，相對(duì)發(fā)芽率(%)=處理組發(fā)芽率/對(duì)照組發(fā)芽率×100%。

1.3.2 植物幼苗生長指標(biāo)

根據(jù)鄧桂榮等[12]的方法進(jìn)行幼苗培養(yǎng)，培養(yǎng)0、2、4、6和8 d后測定植物幼苗的根長、株高和濕重，所有指標(biāo)均重復(fù)3次，取平均值。使用處理組根長(或株高、濕重)減去對(duì)照組根長(或株高、濕重)計(jì)算出差值，然后計(jì)算出差值與對(duì)照組根長(或株高、濕重)的比值，得出生長減少率(%)。

1.3.3 葉綠素?zé)晒馓匦?/p>

根據(jù)周玉霞等[13]的方法，在暴露的第5天，將黃瓜和大豆幼苗第3片真葉暗處理20 min后，利用葉綠素?zé)晒鉁y試儀(Yaxin-1161G型，北京雅欣理儀科技有限公司)測試其光合作用參數(shù)，設(shè)置光化強(qiáng)度2 500 lx，持續(xù)時(shí)間5 s，獲得葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線(OJIP曲線)以及最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和潛在光化學(xué)效率(Fv/Fo)等葉綠素?zé)晒鈪?shù)[14]，與暴露0 d的空白對(duì)照組(CK2T)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比。

1.3.4 植物體內(nèi)PCB28和菲的含量

參考文獻(xiàn)[15-16]的方法，利用德國Bruker公司的456 GC-SCION TQ型氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS/MS)測定植物根、莖和葉中PCB28和菲的含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析與計(jì)算

用Origin8.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算半數(shù)致死濃度(LC50)和半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)并作圖，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 種子的發(fā)芽率

如表1所示，PCB28的中、高濃度組、菲高濃度組以及PCB28+高濃度菲復(fù)合暴露組中大豆種子的相對(duì)發(fā)芽率分別為80%、60%、80%和80%，其余濃度組中大豆種子的相對(duì)發(fā)芽率為90%和100%。PCB28高濃度組和菲高濃度組中大豆種子的發(fā)芽勢分別為13.33%和20%，均≤20%，其余處理組中大豆種子的發(fā)芽勢均>20%。對(duì)黃瓜種子而言，PCB28高濃度組、菲高濃度組和PCB28+高濃度菲復(fù)合暴露組中相對(duì)發(fā)芽率為60%、70%和70%，均<80%，PCB28高濃度組、菲高濃度組中發(fā)芽勢均<30%。所有的高濃度組中2類植物種子的相對(duì)發(fā)芽率和發(fā)芽勢與對(duì)照組之間均存在顯著性差異(P<0.05)。這表明，高濃度PCB28和菲對(duì)種子萌發(fā)產(chǎn)生了明顯的毒害作用。如表2所示，復(fù)合暴露下大豆的LC50明顯大于單一暴露，菲暴露下黃瓜的LC50明顯大于PCB28和復(fù)合暴露。

表1 2,4,4’-三氯聯(lián)苯(PCB28)和菲暴露對(duì)大豆和黃瓜種子發(fā)芽的影響Table 1 Effects of 2,4,4’-trichlorobiphenyl (PCB28) and phenanthrene on the germination of soya bean and cucumber seeds

表2 大豆和黃瓜種子死亡率與濃度對(duì)數(shù)的曲線方程和半數(shù)致死濃度(LC50)Table 2 Logarithmic concentration curve equation and median lethal concentration (LC50) for mortality of soya bean and cucumber seeds

2.2 植物幼苗生長特征

2.2.1 大豆幼苗生長量

大豆幼苗根長生長減少率如圖1(a)所示，高濃度PCB28組，從第2天到第8天，大豆幼苗根長生長減少率從50%變化至90%，并維持在90%左右；中濃度PCB28組，第4天之前生長減少率超過75%，隨后下降，第8天根長生長減少率為負(fù)，這表明中濃度PCB28在暴露后期可促進(jìn)幼苗根生長；低、中濃度菲暴露組，在第8天時(shí)，大豆幼苗根長生長減少率>90%，高濃度菲暴露組在第4天及之后大豆幼苗根長生長減少率維持在95%左右；PCB28+低、中濃度菲復(fù)合暴露組在4 d后根長生長減少率為70%以上。

圖1 PCB28和菲暴露對(duì)大豆幼苗根長和株高的影響Fig. 1 Effects of PCB28 and phenanthrene on the root length and stem length of soya bean seedlings

大豆幼苗株高生長減少率如圖1(b)所示，PCB28和菲單獨(dú)暴露下，第2天中濃度組大豆幼苗株高生長減少率最高，在第4天及之后高濃度組生長減少率最高，如高濃度菲暴露組在4、6和8 d時(shí)生長減少率分別為95%、92%和98%。低濃度菲暴露組在第6天時(shí)生長減少率為-30%，到第8天時(shí)為50%以上，這說明低濃度菲長期暴露也會(huì)影響植物幼苗的株高。

大豆根長生長減少率的EC50如表3所示，菲和復(fù)合暴露的EC50都大于PCB28暴露，說明PCB28對(duì)大豆根長的抑制作用更明顯。

圖2 PCB28和菲暴露對(duì)大豆幼苗濕重的影響Fig. 2 Effects of PCB28 and phenanthrene on the wet weight of soya bean seedlings

表3 大豆根長和株高生長減少率與濃度對(duì)數(shù)的曲線方程和半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)Table 3 Logarithmic concentration curve equation and median effect concentration (EC50) for the reduction rate of root and stem length of soya bean

大豆幼苗濕重生長減少率如圖2所示，高濃度PCB28組在第2天幼苗濕重生長減少率>50%，高濃度菲暴露組在第4天時(shí)大豆幼苗濕重生長減少率達(dá)99%，PCB28+高濃度菲復(fù)合暴露組在第6天以后生長減少率維持在90%以上。PCB28和菲單一及復(fù)合暴露的中濃度組，大豆幼苗濕重生長減少率隨暴露時(shí)間沒有統(tǒng)一的變化規(guī)律。PCB28低濃度組、菲低濃度組和PCB28+低濃度菲復(fù)合暴露組，第6天時(shí)大豆幼苗濕重生長減少率分別為-8%、-35%和-33%，這說明低濃度PCB28和菲暴露有助于大豆幼苗濕重的增加。

大豆幼苗濕重生長減少率的EC50如表4所示，菲和復(fù)合暴露的EC50都小于PCB28暴露的，說明菲和PCB28復(fù)合暴露對(duì)大豆幼苗濕重的抑制作用更明顯。

2.2.2 黃瓜幼苗生長量

黃瓜幼苗根長生長減少率如圖3(a)所示，PCB28高濃度組、菲高濃度組和PCB28+高濃度菲復(fù)合暴露組，第2天時(shí)黃瓜幼苗根長生長減少率最高，分別為98%、92%和95%。PCB28和菲單一及復(fù)合暴露的中濃度組，黃瓜幼苗根長生長減少率大體呈現(xiàn)“N”字型變化趨勢，第8天時(shí)，除了菲中濃度組，其他中濃度組均在70%以上。PCB28和菲單一及復(fù)合暴露低濃度組，第6天時(shí)黃瓜幼苗根長生長減少率均為負(fù)值，這表明PCB28和菲低濃度暴露可促進(jìn)黃瓜幼苗根的生長。

黃瓜幼苗株高生長減少率如圖3(b)所示，PCB28和菲單一及復(fù)合暴露高濃度組，黃瓜幼苗株高生長減少率維持在50%以上。除了菲中濃度組，其余中濃度組黃瓜株高生長減少率均>0。菲低濃度組第8天時(shí)株高生長減少率為-40%，PCB28低濃度組和PCB28+低濃度菲復(fù)合暴露組，第4天時(shí)株高生長減少率為-5%和-9%。

圖3 PCB28和菲暴露對(duì)黃瓜幼苗根長和株高的影響Fig. 3 Effects of PCB28 and phenanthrene on the root length and stem length of cucumber seedlings

表4 大豆?jié)裰厣L減少率與濃度對(duì)數(shù)的曲線方程和EC50Table 4 Logarithmic concentration curve equation and EC50 for the reduction rate of wet weight of soya bean

黃瓜根長和株高生長減少率的EC50如表5所示，PCB28暴露的EC50明顯小于菲和復(fù)合暴露的，說明PCB28對(duì)黃瓜根長和株高的抑制作用更明顯。

表5 黃瓜根長和株高生長減少率與濃度對(duì)數(shù)的曲線方程和EC50Table 5 Logarithmic concentration curve equation and EC50 for the reduction rate of root and stem length of cucumber

黃瓜幼苗濕重生長減少率如圖4所示，PCB28和菲單一及復(fù)合暴露的中、高濃度組中，濕重生長減少率在65%～98%之間。這說明中、高濃度暴露會(huì)降低黃瓜幼苗的濕重。

圖4 PCB28和菲暴露對(duì)黃瓜幼苗濕重的影響Fig. 4 Effects of PCB28 and phenanthrene on the wet weight of cucumber seedlings

黃瓜幼苗濕重生長減少率的EC50如表6所示，菲暴露的EC50大于PCB28和復(fù)合暴露的，說明菲對(duì)黃瓜幼苗濕重的抑制作用更小。

2.3 植物葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)

幼苗葉片F(xiàn)v/Fm如圖5(a)所示，F(xiàn)v/Fm從大到小順序?yàn)榈蜐舛冉M>中濃度組>高濃度組。高濃度組大豆幼苗葉片的Fv/Fm最低，約為0.26～0.41，與對(duì)照組(0.73)比較，有顯著性差異(P<0.01)。中濃度組大豆幼苗葉片的Fv/Fm為0.45～0.63，與對(duì)照組比較，存在顯著性差異(P<0.05)。對(duì)黃瓜幼苗葉片而言，PCB28高濃度組和PCB28+高濃度菲復(fù)合暴露組的Fv/Fm分別為0.02和0.21，與對(duì)照組比較，存在顯著性差異(P<0.01)，但菲暴露組的Fv/Fm為0.6～0.75，與對(duì)照組(0.62)比較，差異不顯著。所有低、中濃度組黃瓜幼苗Fv/Fm與大豆幼苗的基本一致。

幼苗葉片的Fv/Fo如圖5(b)所示，經(jīng)PCB28和菲單一暴露5 d后，2類植物幼苗葉片F(xiàn)v/Fo較對(duì)照組明顯下降，隨著暴露濃度增大，F(xiàn)v/Fo下降更明顯。菲低、高濃度組大豆幼苗葉片的Fv/Fo分別為2.69和0.36，PCB28低、高濃度組黃瓜幼苗葉片的Fv/Fo分別為2.56和0.02。這說明，PCB28和菲脅迫對(duì)2類幼苗的生長產(chǎn)生抑制作用，影響光系統(tǒng)Ⅱ的電子傳遞，導(dǎo)致Fv/Fo降低。

圖5 大豆和黃瓜葉片最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和潛在光化學(xué)效率(Fv/Fo)注：CK2T表示暴露0 d時(shí)植物葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)空白對(duì)照組。Fig. 5 Maximum photochemical efficiency (Fv/Fm) and potential photochemical efficiency (Fv/Fo) of leaves of soya bean and cucumberNote: CK2T represents blank control group of chlorophyll fluorescence parameters of plant leaves on 0 d.

表6 黃瓜濕重生長減少率與濃度對(duì)數(shù)的曲線方程和EC50Table 6 Logarithmic concentration curve equation and EC50 for the reduction rate of wet weight of cucumber

2.4 植物幼苗體內(nèi)污染物的含量

如表7所示，PCB28中、高濃度組中，在大豆和黃瓜各部位中均未檢出PCB28。低濃度PCB28脅迫下，PCB28在大豆和黃瓜各部位的含量均呈現(xiàn)出根>莖>葉。在所有菲暴露組中，菲在大豆和黃瓜各部位的含量也都呈現(xiàn)出根>莖>葉。在復(fù)合暴露下，中、高濃度組中，大豆各部位對(duì)菲的吸收呈現(xiàn)出根>莖>葉。在復(fù)合暴露下，黃瓜各部位對(duì)菲的吸收同樣呈現(xiàn)出根>莖>葉，且中、高濃度組黃瓜根部和莖部對(duì)菲的吸收遠(yuǎn)大于葉對(duì)菲的吸收。

表7 大豆和黃瓜幼苗各部位中PCB28和菲含量Table 7 The PCB28 and phenanthrene content of each part of soya bean and cucumber seedlings (μg·g-1)

3 討論(Discussion)

3.1 對(duì)種子萌發(fā)的影響

Drwal等[17]的研究表明，PAHs可以直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡。同時(shí)，污染物可以通過影響酶活性而影響種子萌發(fā)[18]。根據(jù)本研究結(jié)果可知，PCBs和PAHs對(duì)植物種子萌發(fā)有明顯抑制作用。PCB28的中、高濃度組、菲高濃度組以及PCB28+高濃度菲復(fù)合暴露組中，大豆種子的相對(duì)發(fā)芽率較對(duì)照組有顯著性降低(P<0.05)。PCB28高濃度組、菲高濃度組以及PCB28+高濃度菲復(fù)合暴露組中，大豆種子的發(fā)芽勢與對(duì)照組比較有顯著性降低(P<0.05)。PCB28和菲單一及復(fù)合暴露低濃度組的大豆種子發(fā)芽勢低于對(duì)照組(P<0.05)。PCB28高濃度組、菲高濃度組以及PCB28+高濃度菲復(fù)合暴露組中，黃瓜種子的相對(duì)發(fā)芽率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，所有PCB28和菲單一及復(fù)合暴露組的發(fā)芽勢均未大于對(duì)照組。綜合分析結(jié)果可知，PCB28和菲對(duì)種子萌發(fā)全程以及萌發(fā)前期都存在影響。這與陳方圓等[19]的研究結(jié)果略有不同，其研究結(jié)果表明，黃瓜種子萌發(fā)前期受污染物影響較小。這可能與暴露濃度及相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件不同有關(guān)。

3.2 對(duì)植物幼苗生長的影響

郭敏等[20]的研究表明，在受到有毒污染物脅迫時(shí)，植物會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，直接影響到根部對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和細(xì)胞的生長。根據(jù)劉靜等[21]的研究，當(dāng)菲的濃度較低時(shí)，可以促進(jìn)植物幼苗地上部和地下部的生長，同時(shí)菲對(duì)植物各部分影響存在差別[22]。這與本研究的結(jié)果類似，低濃度菲暴露組中幼苗生長要優(yōu)于低濃度PCB28組和空白對(duì)照組。羅春燕等[8]的研究表明，復(fù)合污染脅迫下，其余污染物會(huì)減少植物幼苗對(duì)菲的吸收，且復(fù)合污染暴露組中植物幼苗所受影響小于單一菲暴露組。本研究表明，高濃度PCB28和菲單一暴露對(duì)植物生長抑制作用明顯，但中、低濃度PCB28和菲單一暴露時(shí)，有促進(jìn)植物生長的情況發(fā)生。復(fù)合暴露組對(duì)黃瓜幼苗株高的影響小于單一暴露組，這表明復(fù)合暴露組可能存在拮抗作用。

3.3 對(duì)植物葉片熒光參數(shù)的影響

PCB28和菲單一及復(fù)合暴露的所有高濃度組的Fv/Fm和Fv/Fo顯著低于中、低濃度組。閆帥等[23]的研究表明，高濃度污染物脅迫下，植物幼苗體內(nèi)的活性氧含量會(huì)增加，影響光合電子傳遞，損傷光合系統(tǒng)，直接影響到植物的光化學(xué)效率，導(dǎo)致Fv/Fm和Fv/Fo降低。

3.4 植物體內(nèi)各部位污染物的含量

微生物(真菌)可以促進(jìn)植物對(duì)PCBs的吸收和降解[24]，但高濃度的PCBs會(huì)直接威脅到植物根系和微生物的生長，從而減少植物對(duì)PCBs的吸收和分解[25]。

研究表明，生物有適應(yīng)環(huán)境逆境的調(diào)控機(jī)制，植物可以通過降低新陳代謝應(yīng)對(duì)外界威脅[26-27]。根據(jù)本研究結(jié)果可知，中、高濃度的PCB28暴露組中，大豆和黃瓜幼苗體內(nèi)未檢測到PCB28，推測大豆和黃瓜幼苗通過減少對(duì)PCB28的吸收來對(duì)抗脅迫，但似乎2種幼苗體內(nèi)缺少對(duì)菲脅迫的響應(yīng)機(jī)制，中、高菲濃度組中對(duì)菲均有吸收。

污染物在植物各器官內(nèi)的富集具有明顯的規(guī)律性，且不同植物對(duì)污染物的富集原理存在差異，各器官間富集規(guī)律不同[28-29]。大豆和黃瓜幼苗各部位內(nèi)PCB28和菲的含量呈現(xiàn)出根部>莖部>葉部，規(guī)律性明顯，但黃瓜幼苗內(nèi)PCB28的分布較大豆幼苗均勻，且復(fù)合脅迫下大豆幼苗各部位對(duì)污染物的吸收較黃瓜幼苗均勻，這與植物種類或污染物間的拮抗作用有一定關(guān)系。