抗生素磺胺對附著藻類在苦草葉片上定植及演替的影響

朱利明，陳小雨，肖文勝，尹昱蘇，徐后濤，鄭小燕，張瑋,*，王麗卿,#

1. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海 201306 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306 3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306 4. 上海水生環(huán)境工程有限公司，上海 201306

磺胺類抗生素(SAs)是一種價格低廉，具有廣譜性抗菌特點的抗生素；該類抗生素已作為人類用藥、獸藥和飼料添加劑在世界各國使用數(shù)十年[1]。目前，其在歐盟的使用量僅次于四環(huán)素類抗生素[2-3]。中國是抗生素的生產(chǎn)和消費大國，據(jù)統(tǒng)計，2013年中國抗生素生產(chǎn)量為24.8萬t，國內(nèi)消耗16.2萬t，其中SAs占抗生素生產(chǎn)總量的5%[4]。由于這些抗生素不能完全被生物體代謝，它們通常以母體以及代謝產(chǎn)物的形式被排放到環(huán)境中[5]。此外，廢水處理過程中對其清除不徹底，也導(dǎo)致其被持續(xù)釋放到水環(huán)境中，因此在水環(huán)境中經(jīng)常檢測到SAs的存在[5]。在上海地區(qū)，自然水體、飼養(yǎng)場廢水收集池以及灌溉水渠中都有檢測到SAs，其中，自然水體中SAs濃度為219～323 ng·L-1，養(yǎng)殖水體和灌溉水體中SAs濃度為198～323 μg·L-1[6-8]。另有研究發(fā)現(xiàn)，地下水中也檢測到SAs的存在，濃度甚至高達410 ng·L-1[9-10]。盡管水環(huán)境中SAs的平均濃度較低(ng·L-1或μg·L-1水平)，但因其持續(xù)排放，成為水體中的一類新型的“持久性”污染物；SAs可對水生生物群落結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性產(chǎn)生嚴重影響，并通過食物鏈的傳遞，影響高級生物，甚至人類健康[11-12]。

附著藻類是淺水湖泊生態(tài)系統(tǒng)的重要初級生產(chǎn)者，在維持水生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性、物質(zhì)轉(zhuǎn)移和能量傳遞以及水質(zhì)凈化等方面起著重要的作用[13]。已有研究表明，氮磷營養(yǎng)鹽的變化會引起藻類群落結(jié)構(gòu)的演替[14-17]，氨氮濃度可對附著藻類在沉水植物葉片上的定植規(guī)律產(chǎn)生影響[18-19]。目前，關(guān)于抗生素對藻類影響的研究主要集中在對純種藻株的毒理作用，例如，四環(huán)素類金霉素等會顯著影響銅綠微囊藻、蛋白核小球藻和斜生柵藻的生物膜通透性及細胞色素的積累等[20-22]；高濃度氯霉素、氟苯尼考對小球藻的生長可產(chǎn)生阻礙作用[23]。另外，關(guān)于純種藻類對抗生素的去除研究也有少量報道，如小球藻、四尾柵藻等可以通過脫羧化、去甲基化的方式進行生物轉(zhuǎn)化或生物催化從而降解環(huán)丙沙星、左氧氟沙星等抗生素[24-29]。但關(guān)于抗生素暴露條件下藻類群落水平的變化規(guī)律尚鮮有研究。

SAs的作用機理是抑制葉酸的生物合成途徑，因此，SAs很可能對除細菌外的其他生物也有不同程度的副作用，如微藻、浮游動物、魚類和大型植物等[3,11,30]?？嗖?Vallisnerianatans(Lour.) Hara)是一種完全浸沒的多年生生根植物，在我國淡水中廣泛分布，其在釋放氧氣、為水生動物提供食物和住所以及通過毒素的積累或分解來維持水生生態(tài)系統(tǒng)的健康方面具有重要作用[31]。已有研究發(fā)現(xiàn)，苦草及其葉片附著微生物在去除水體抗生素磺胺(SN)方面具有顯著的作用[32]。但是關(guān)于SN等對附著藻類群落結(jié)構(gòu)、定植速率以及演替規(guī)律的影響研究極少。因此，本研究探討了不同濃度的SN暴露對附著藻類在沉水植物苦草葉片表面定植及演替規(guī)律的影響，以便進一步研究其對沉水植物生長的影響，為后期應(yīng)用“沉水植物-附著生物復(fù)合系統(tǒng)”來治理抗生素污染水體提供新的思路。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗試劑

磺胺(sulfonamide)純度≥99.8%，購于國藥集團藥業(yè)有限公司，其物化性質(zhì)如表1所示。

表1 磺胺(SN)的物化性質(zhì)Table 1 Physico-chemical properties of sulfonamide (SN)

1.2 實驗材料

于上海海洋大學(xué)臨港校區(qū)明湖中采集苦草(水質(zhì)基本狀況如表2所示)，將葉片表面清洗干凈，將清洗好的苦草移載于塑料箱(40 cm×60 cm×50 cm)進行預(yù)培養(yǎng)15 d。選取長勢相近、株長約20 cm的苦草，再次將其表面附著藻類輕輕刷去清除，移栽到7 L的玻璃標(biāo)本瓶中，以透明玻璃珠作為固定基質(zhì)(直徑為6 mm)；每個標(biāo)本瓶中種植5株苦草，再次進行預(yù)培養(yǎng)7 d。2次預(yù)培養(yǎng)的營養(yǎng)液均是以曝氣自來水為溶劑配制的10% Hoagland營養(yǎng)液[33]。接種的附著藻類來源于上海海洋大學(xué)校園水系沉水植物和水底石塊，采集到的沉水植物和石塊用軟毛刷刷洗表面，將刷洗液定容，一部分留屬種鑒定所用，另一部分分別等量接種到各處理組中。經(jīng)鑒定所采集的附著藻類隸屬于5門45屬，其中藍藻門主要有顫藻屬、色球藻屬，硅藻門主要有菱形藻屬、舟形藻屬、針桿藻屬和脆桿藻屬，綠藻門主要有絲藻屬、小球藻屬。其他門的種類較少。

表2 上海海洋大學(xué)校園水系水質(zhì)狀況Table 2 Water quality of campus water system of Shanghai Ocean University

1.3 實驗設(shè)計

已有的毒理學(xué)研究表明，藻類對高濃度抗生素具有較好的耐受性，通常設(shè)置10～200 mg·L-1濃度進行實驗[26-27]。因此，為了更好地探討SN對附著藻類在苦草葉片上定植及演替的影響，設(shè)計1個對照組(0 mg·L-1)和3個SN處理組(10、30和50 mg·L-1)共4個不同SN濃度水平，每組4個重復(fù)，實驗在室內(nèi)環(huán)境中進行，室內(nèi)溫度為(32±1) ℃?？嗖萁?jīng)過2次預(yù)培養(yǎng)后，更換標(biāo)本瓶中營養(yǎng)液為含不同SN濃度的營養(yǎng)液，然后再將取自于沉水植物上的附著藻類樣品等量均勻地加入每個玻璃標(biāo)本瓶，每瓶約100 mL，4 d后采集附著藻類。每次每瓶取苦草葉片面積約為40 cm2，用蒸餾水及軟毛刷反復(fù)刷洗苦草葉片，得到附著藻類樣品，加入15‰魯哥氏碘液和4%福爾馬林溶液固定，并定容到50 mL備用。為保證各處理組SN濃度穩(wěn)定，采樣后更換培養(yǎng)液，以后每隔4 d采樣一次并更換一次培養(yǎng)液。

1.4 附著藻類的鑒定及計數(shù)

將濃縮后的樣品搖勻，取0.1 mL于帕默爾計數(shù)框內(nèi)，在400倍光學(xué)顯微鏡下進行種類鑒定，具體處理和鑒定方法參照文獻[34]。藻類相對豐度Pi=Ni/N×100，式中：Ni為第i物種的個體數(shù)，N為總個體數(shù)；以相對豐度>1%的物種為優(yōu)勢類群[35]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

運用EXCEL 2007進行數(shù)據(jù)預(yù)處理，用origin 9.0作圖。采用R 3.2.5中的vegan包進行主坐標(biāo)分析(PCoA)，比較3個實驗組與1個對照組間藻類群落結(jié)構(gòu)相似性及差異性。熱度圖采用EXCEL 2007繪制，并分析附著藻類群落結(jié)構(gòu)隨磺胺濃度的變化。采用Past3生物數(shù)據(jù)分析軟件計算附著藻類群落α多樣性指數(shù)，數(shù)據(jù)間的顯著性差異采用單因素方差分析，用SPSS19.0軟件完成，在進行方差分析前，對數(shù)據(jù)進行了方差齊性和正態(tài)分布的檢驗，若方差齊性，選擇LSD檢驗，反之使用Dunnett’s檢驗(P<0.05)。所有數(shù)據(jù)以Mean±SD表示。

2 結(jié)果(Results)

2.1 不同濃度的SN對附著藻類定植速率的影響

通過熱圖分析不同濃度的SN處理條件下，各處理組中附著藻類定植速率的差異(圖1)。4 d后在0 mg·L-1處理組中首先成為優(yōu)勢類群的是綠藻門(絲藻屬、小球藻屬)和藍藻門(顫藻屬、鞘絲藻屬和色球藻屬)，此后硅藻門的菱形藻屬和舟形藻屬也成為優(yōu)勢類群，但是相對豐度較低。10 mg·L-1處理組中4 d后成為優(yōu)勢類群的有絲藻屬、顫藻屬和舟形藻屬；菱形藻屬在第8天成為優(yōu)勢類群，脆桿藻屬在第12天成為優(yōu)勢類群，針桿藻屬和小環(huán)藻屬在第16天成為優(yōu)勢類群。30 mg·L-1處理組中4 d后率先成為優(yōu)勢類群的主要有絲藻屬、顫藻屬和菱形藻屬，相對于對照組和10 mg·L-1處理組相對豐度較少，其他一些硅藻在12 d內(nèi)陸續(xù)成為優(yōu)勢類群。在50 mg·L-1處理組中也發(fā)現(xiàn)了類似30 mg·L-1處理組的規(guī)律。

圖1 不同濃度SN處理組中主要附著藻類類群的定植及演替過程注：紅色方塊的寬窄表示相對豐度的大小。Fig. 1 Process of colonization and succession of epiphytic algae in each treatment group with different SN concentrationNote: The width of the red square indicates the relative abundance.

2.2 不同濃度的SN對附著藻類種群演替的影響

在0 mg·L-1處理組的附著藻類種群的整個演替過程中發(fā)現(xiàn)，隨著時間的推移成為優(yōu)勢類群的藻類依次為：4 d(絲藻屬、顫藻屬和小球藻屬)、8 d(菱形藻屬和舟形藻屬)、12 d后(卵形藻屬)。其中，絲藻屬的相對豐度隨著時間逐漸下降，12 d后趨于穩(wěn)定。顫藻屬、菱形藻屬和小球藻屬的相對豐度隨時間逐步上升。舟形藻屬和卵形藻屬的相對豐度較低(圖2(a))。結(jié)合圖1分析可知，20 d后基本形成了以硅藻門(針桿藻屬、脆桿藻屬和菱形藻屬)和藍綠藻門(顫藻屬、絲藻屬和小球藻屬)共存的穩(wěn)定群落。

圖2 不同SN處理組中附著藻類相對豐度的變化注：虛線以上為優(yōu)勢屬；(a) 0 mg·L-1，(b) 10 mg·L-1，(c) 30 mg·L-1，(d) 50 mg·L-1。Fig. 2 Relative abundance of epiphytic algae in different SN treatment groupsNote: Above the dotted line is the dominant genus; (a) 0 mg·L-1; (b) 10 mg·L-1; (c) 30 mg·L-1; (d) 50 mg·L-1.

4 d后，10 mg·L-1處理組中絲藻屬和顫藻屬首先定植成為優(yōu)勢類群(圖2(b))。第8天菱形藻屬、舟形藻屬以及小球藻屬成為優(yōu)勢類群；16 d后脆桿藻屬和針桿藻屬定植成為優(yōu)勢類群，但舟形藻屬逐漸消失。其中，絲藻屬的相對豐度逐漸下降，且相對豐度與對照組接近；顫藻屬的相對豐度也呈下降趨勢，總體豐度低于對照組；硅藻門的藻類(菱形藻屬、脆桿藻屬和針桿藻屬)定植速率較慢，但其相對豐度隨時間呈上升趨勢，其中菱形藻屬相對豐度遠高于對照組和其他2個SN處理組。從30 mg·L-1處理組中附著藻類種群演替過程可以看出(圖2(c))，第4天成為優(yōu)勢類群的有顫藻屬、絲藻屬、色球藻屬和菱形藻屬，但只有顫藻屬和絲藻屬的相對豐度較大；8 d后小球藻屬成為優(yōu)勢種群；12 d后色球藻屬由于不能很好地適應(yīng)較高的SN濃度，逐漸消失。從相對豐度角度分析(圖2(c))，絲藻屬和顫藻屬逐漸下降；菱形藻屬和小球藻屬隨時間呈上升趨勢，表明其對SN具有較強的耐受性。50 mg·L-1處理組(圖2(d))附著藻類在4 d后最先成為優(yōu)勢類群的是絲藻屬、顫藻屬、色球藻屬和小球藻屬；第8天時，色球藻屬消失，對比30 mg·L-1處理組色球藻屬變化規(guī)律(圖2(c))可知，更高的SN濃度使其更快的消亡；16 d后，脆桿藻屬、針桿藻屬和小環(huán)藻屬成為優(yōu)勢類群，其中小環(huán)藻屬相對豐度較低。由圖2(d)可知，絲藻屬、顫藻屬以及色球藻屬的相對豐度隨時間逐漸下降；小球藻屬、菱形藻屬、脆桿藻屬和針桿藻隨時間呈上升趨勢。

綜合比較4個處理組中苦草表面附著藻類20 d的定植規(guī)律發(fā)現(xiàn)，最先定植的是藍藻門的顫藻屬，綠藻門的絲藻屬。硅藻門的藻類一般在8 d后才會逐漸成為優(yōu)勢類群。針桿藻屬、脆桿藻屬、菱形藻屬、小球藻屬和絲藻屬對SN具有一定的耐受能力，SN對色球藻屬、顫藻屬和舟形藻屬的影響較大。

2.3 不同濃度的SN對附著藻類群落結(jié)構(gòu)的影響

運用PCoA分別對不同處理組各采樣時間點進行附著藻類群落β多樣性的比較分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)在4 d時，處理組A(對照組)與處理組D(50 mg·L-1SN)間表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)，8 d時，處理組A(對照組)與處理組B(10 mg·L-1SN)、處理組C(30 mg·L-1SN)間具有顯著差異(P<0.05)，其余組間群落結(jié)構(gòu)差異不顯著(P>0.05)。12 d時，處理組C(30 mg·L-1SN)與處理組D(50 mg·L-1SN)之間附著藻類群落結(jié)構(gòu)差異性顯著(P<0.05)，其他處理組之間均不存在顯著性差異(P>0.05)。第16天和第20天時，各處理組之間均無顯著性差異(P>0.05)，群落結(jié)構(gòu)較為相似。如圖4所示，實驗結(jié)束后，D處理組(50 mg·L-1SN)的α多樣性指數(shù)顯著小于對照組和其他SN處理組(P<0.05)。

圖3 藻類群落的主坐標(biāo)分析(PcoA)注：A. 0 mg·L-1，B. 10 mg·L-1，C. 30 mg·L-1，D. 50 mg·L-1；(a) 4 d，(b) 8 d，(c) 12 d，(d) 16 d，(e) 20 d；*P<0.05。Fig. 3 The principal co-ordinates analysis (PcoA) of algae communityNote: A. 0 mg·L-1, B. 10 mg·L-1, C. 30 mg·L-1, D. 50 mg·L-1; (a) 4 d, (b) 8 d, (c) 12 d, (d) 16 d, (e) 20 d; *P<0.05.

圖4 SN暴露20 d時苦草葉片附著藻類群落α多樣性指數(shù)的變化注：所有數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，n=4；不同的字母表示2組之間具有顯著性差異(P<0.05)。Fig. 4 Changes of α diversity index of epiphytic algae communities in V. natans leaves after SN exposure for 20 dNote: Data are shown as the mean±SD (n=4); different letters represent significant difference at the P<0.05 level.

3 討論(Discussion)

3.1 SN對附著藻類定植速率的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，在不同濃度SN脅迫下，苦草表面附著藻類的定植速率受到了不同程度的影響?？傮w來說，各處理組中絲藻屬和顫藻屬相比其他藻類更容易定植到苦草葉片表面；在第4天時只有3種硅藻定植，且只在對照組和10 mg·L-1處理組出現(xiàn)，較高SN濃度(30 mg·L-1和50 mg·L-1)條件下并未發(fā)現(xiàn)；硅藻的定植種類在第12天后逐漸增加(圖1)。已有研究發(fā)現(xiàn)，夏季高溫環(huán)境更利于藍藻和綠藻成為優(yōu)勢種[36-37]，這與本研究環(huán)境相似。硅藻作為一種指示生物，其種群數(shù)量可以反映環(huán)境的污染程度[38]，本研究中高濃度的SN對其造成了一定影響。已有研究表明，包括尖針桿藻(Synedraacus)、曲殼藻(Achnanthessp.)在內(nèi)的6種硅藻的生物量與水溫度負相關(guān)，適合在低溫下生活[39]。也有研究表明，菱形藻屬的最適溫度多處于10～30 ℃之間，較高或較低的溫度都會對其生長產(chǎn)生負面影響[40]。附著藻類的生長及發(fā)展受周圍諸多環(huán)境因子的影響，不同季節(jié)附著藻類的種類有差異[41]；不同光照強度下，附著藻類的生物量也會不同[42]。本實驗溫度維持在(32±1) ℃，較高的實驗溫度可能并不適合硅藻的定植。此外，本實驗中苦草葉片上定植的附著藻類為人工添加，并且SN濃度遠高于環(huán)境濃度，因此定植速率可能與現(xiàn)實環(huán)境有一定的差異。

3.2 SN對附著藻類演替規(guī)律的影響

本研究的各處理組中，附著藻類的演替規(guī)律也有所不同(圖1和圖2)。SN處理組中絲藻屬、顫藻屬和色球藻屬的相對豐度隨時間呈現(xiàn)下降的趨勢，且藍藻門的顫藻屬和色球藻屬受SN的影響較大；高濃度的SN(30 mg·L-1和50 mg·L-1)促進了小球藻屬的定植生長；較低濃度的SN(10 mg·L-1)刺激了菱形藻屬的定植和生長，高濃度SN(30 mg·L-1和50 mg·L-1)抑制了其定植生長(圖2)。7種氟喹諾酮類抗生素對5種水生生物的毒性研究表明，藍細菌(銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa))是最敏感的生物，其次是浮萍(Lemnaminor)和綠藻[43]。另有研究表明，四環(huán)素類抗生素能夠抑制銅綠微囊藻和綠藻的蛋白質(zhì)合成，并且可能通過抑制葉綠體酶的活性，對植物生長產(chǎn)生抑制作用[20,44-45]。大多數(shù)抗生素對以銅綠微囊藻為代表的藍藻的毒性要大于綠藻、隱藻等其他種群[43]，常通過影響藻類細胞成分、改變細胞膜的通透性、影響基因表達、阻礙光合作用進程、誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧自由基、引發(fā)氧化脅迫和破壞抗氧化酶系統(tǒng)等方式來影響藍藻[46-48]。在本研究中，藍藻門的顫藻屬和色球藻屬的相對豐度受SN的影響最大(圖2)。小球藻相對于水華束絲藻(Aphanizomenonflosaquae)、顫藻、水華微囊藻(Microcystisflos-aquae)，對羥基苯甲酸的耐受性更強[49]；另外還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，綠藻對于抗生素的耐受性較高，其中小球藻(Chlorellasp.)和微綠球藻(Nannochloropsis)對氯霉素、四環(huán)素、卡那霉素和氨芐青霉素都不敏感[50]。Xiong等[51]的研究也表明，小球藻對恩諾沙星具有一定的耐受性，且其對恩諾沙星去除率最高可達26%。藻類在受到脅迫時會釋放藻類胞外聚合物(extracellular polymeric substance, EPS)，其主要成分為蛋白質(zhì)和多糖，可以起到保護細胞，使其凝聚為團體以抵御捕食等作用[52]。在本研究中，綠藻門的小球藻屬對SN具有很強的耐受性，且高濃度的SN(30 mg·L-1和50 mg·L-1)促進了其定植生長(圖2(c)和圖2(d))?！岸拘耘d奮效應(yīng)(Hormesis)”是指污染物在低劑量下刺激受試物種生長、高劑量下抑制其生長現(xiàn)象的劑量-反應(yīng)關(guān)系[53]。SN對菱形藻屬的定植表現(xiàn)出“低促高抑”的現(xiàn)象，顯示出了顯著的“毒性興奮效應(yīng)”(圖2)。施文杰等[54]研究發(fā)現(xiàn)，在低濃度的諾氟沙星(1 mg·L-1)處理下，新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)的終止生物量(Bf)要略高于對照組，這可能與毒性興奮作用有關(guān)。

群落組成最初受隨機性過程控制，但隨著演替的進行，在選擇機制中會存在規(guī)模依賴性[55]。Jackson等[56]的研究表明，在飲用水生物膜形成的初始階段，由于“種源”不同，首先定植的具體物種可能會存在一定的不確定性；微型生物群落的特征是不同種群的定植，缺乏有序的群落結(jié)構(gòu)，這可以部分解釋本研究初始階段各處理組群落結(jié)構(gòu)差異顯著的現(xiàn)象(圖3(a)和圖3(b))。PCoA分析表明，SN脅迫條件下，苦草葉片表面的附著藻類群落結(jié)構(gòu)在脅迫后期，各處理組間差異逐漸減小，一方面可能說明SN的負面影響隨著時間減小，另一方面也是由于SN對附著藻類物種產(chǎn)生的“環(huán)境過濾”、“篩選”效應(yīng)所致，只有對SN耐受較強的物種才可獲得較高的優(yōu)勢度(圖3(e))。實驗結(jié)束后，高濃度SN處理組的α多樣性指數(shù)顯著小于對照組(P<0.05)(圖4)。Kang等[57]的研究也發(fā)現(xiàn)，藥品和個人護理產(chǎn)品(PPCPs)也會降低附著藻類的物種多樣性，這可能與不同物種對這些新型污染物的生理耐受性和生態(tài)適應(yīng)能力有關(guān)。