間接免疫熒光法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)小兒肺炎支原體感染臨床診斷價(jià)值的研究

文/吳婷娜（內(nèi)江市第一人民醫(yī)院）

肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae,MP）是呼吸道感染常見病原體[1]，支原體肺炎即原發(fā)性非典型肺炎，多發(fā)于學(xué)齡前兒童，經(jīng)由呼吸道飛沫傳播，其臨床癥狀和體征不具有特異性，僅憑臨床表現(xiàn)或影像學(xué)檢查等難以與一般病毒或細(xì)菌感染相鑒別，容易漏診而錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)，因此，盡早診斷肺炎支原體感染至關(guān)重要。臨床實(shí)驗(yàn)室肺炎支原體感染的檢測方法包括血清學(xué)檢測、微生物快速培養(yǎng)、分子生物學(xué)檢測等，本研究回顧性分析63 例于我院診斷的小兒肺炎支原體感染患者的情況，所有患者均使用間接免疫熒光法檢測肺炎支原體特異性IgM 抗體及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測肺炎支原體DNA，通過分析檢測結(jié)果，探討兩種檢測方法對(duì)小兒肺炎支原體感染診斷的臨床應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

對(duì)2019 年9 月-2020 年9 月收治入我院的63 例肺炎支原體感染患兒進(jìn)行回顧性分析，所有患兒均符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》中支原體肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有患兒均使用間接免疫熒光法檢測血清肺炎支原體特異性IgM 抗體及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測咽拭子/痰液肺炎支原體DNA。63 例患兒中，男性33 例，女性30 例；年齡1-11 歲，平均年齡（4.86±3.14）歲；病程2-30d，平均病程（9.52±8.58）d，病程<7d 者39 例，病程≥7d 者24 例。

1.2 儀器與試劑

Smart32 全自動(dòng)核酸提取儀（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）、DA7600 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）、EUROStar Ⅲ Plus 熒光顯微鏡（德國歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司）、肺炎支原體核酸檢測試劑盒（PCR 熒光探針法）（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）、呼吸道病原體譜抗體IgM 檢測試劑盒（間接免疫熒光法）（德國歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集

（1）血清：采集患兒的空腹靜脈全血標(biāo)本約2ml并及時(shí)分離出血清，2-8℃保存，24h 內(nèi)完成。

（2）咽拭子：用咽拭子取咽部分泌物，將咽拭子植入無菌玻璃管，密封送檢。

（3）痰液：使用一次性吸痰器，患兒取仰頭平臥位，將吸痰管緩緩插入咽喉部，調(diào)節(jié)負(fù)壓，將氣管深部分泌物（在霧化吸入后效果較好）緩緩吸入儲(chǔ)液瓶中，反復(fù)數(shù)次，儲(chǔ)液瓶中分泌物即為標(biāo)本，密封送檢。

1.3.2 肺炎支原體特異性IgM 抗體檢測

應(yīng)用間接免疫熒光法檢測肺炎支原體特異性IgM 抗體，熒光顯微鏡下觀察到特異性的熒光模型判定為陽性。整個(gè)過程嚴(yán)格按照肺炎支原體特異性IgM 抗體檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。

1.3.3 肺炎支原體DNA 檢測

應(yīng)用核酸提取試劑在核酸提取儀上對(duì)肺炎支原體的DNA 進(jìn)行提取，隨后使用PCR 試劑在PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)結(jié)果進(jìn)行解讀，增長曲線呈S 型曲線且Ct 值<40 判定為陽性。整個(gè)過程嚴(yán)格按照肺炎支原體核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。

1.3.4 觀察指標(biāo)

比較兩種方法的肺炎支原體陽性檢出率；分析兩種方法在不同病程的陽性檢出率情況。不同病程分別為病程<7d和病程≥7d。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示；A 組和B組陽性檢出率的差異性用四格表資料的卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測方法對(duì)肺炎支原體感染檢測結(jié)果的比較

見表1。63 例患者中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢出陽性48 例（76.19%），間接免疫熒光法檢出陽性18 例（28.57%），前者陽性檢出率高于后者，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 不同病程肺炎支原體檢出情況的比較

見表2。對(duì)于病程<7d 的患兒，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的陽性檢出率為92.31%，明顯高于間接免疫熒光法（7.69%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而對(duì)于病程≥7d 的患者，兩種檢測方法陽性檢出率無顯著性差異。

表1 兩種檢測方法診斷肺炎支原體結(jié)果比較[n(%)]

表2 不同病程診斷肺炎支原體結(jié)果比較[n（%）]

3 討論

肺炎支原體是兒科常見的感染性病原體，有報(bào)道稱肺炎支原體肺炎患兒可占住院肺炎患兒的40%[2]。小兒感染肺炎支原體后，由于其臨床表現(xiàn)缺乏特異性，因此鑒別診斷并不容易，常常出現(xiàn)誤診或漏診的情況[3]。該疾病病程可持續(xù)較長時(shí)間，且可發(fā)生較多肺外并發(fā)癥[4]，但肺炎支原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物敏感[5]，因此，如果在感染初期得到有效診斷，對(duì)患兒的治療則具有重大意義。本研究回顧性分析間接免疫熒光法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)肺炎支原體感染的診斷價(jià)值，表1 表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)肺炎支原體感染的陽性檢出率明顯高于間接免疫熒光法，一方面可能是由于PCR 方法的靈敏度及特異度較高，另一方面，48 例實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢出陽性而抗體陰性的患者中，有9 例病程已接近1個(gè)月，Nilsson 等[6]報(bào)道，肺炎支原體急性感染患者喉部殘留的DNA 片段可以存在較長時(shí)間，可持續(xù)45-52d，此時(shí)仍可從患者口咽部檢測到殘留的核酸片段，但特異性IgM 抗體可能已消退至無法檢出。此外，抗體產(chǎn)生亦與年齡、病程、免疫功能等相關(guān)，如對(duì)于年齡較小的患者，其免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不完全，可導(dǎo)致血清學(xué)檢驗(yàn)產(chǎn)生假陰性現(xiàn)象[7]。表2 表明，兩種檢測方法陽性檢出率與病程相關(guān)，對(duì)于病程<7d 的患者，DNA 檢出陽性率高于特異性IgM 抗體，通常，IgM 抗體于感染1 周后出現(xiàn)，一般可持續(xù)3-4 周，因此，對(duì)于病程<7d 的患者，考慮其特異性IgM 抗體還未產(chǎn)生或其濃度低于檢出限，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR 由于其高靈敏度，可在病程早期檢出肺炎支原體DNA。

4 結(jié)論

綜上所述，對(duì)于小兒肺炎支原體感染患者，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 可直接檢測病原體核酸，本研究顯示其陽性檢出率高于血清學(xué)檢測，特別是對(duì)于病程早期患者，分子生物學(xué)方法可及早檢出病原體，有效縮短診斷周期，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。