野生菌株特征功能基因過表達(dá)在食品領(lǐng)域中的研究進(jìn)展

申 可，王曉丹*，周鴻翔，邱樹毅，班世棟，羅小葉

（1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽550025；2.貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗室，貴州 貴陽550025）

野生菌株是指從自然界分離到的微生物的原始菌株，其種類繁多，具備許多特征功能，如地衣芽孢桿菌擁有較強(qiáng)的抑菌能力[1]，蘇云金芽孢桿菌對節(jié)肢動物具有毒殺活性[2]，假絲酵母具有較強(qiáng)的產(chǎn)脂肪酶能力[3]。早期，科研者對于野生菌株的研究僅限于功能菌株篩選、菌種鑒定及培育發(fā)酵等。20世紀(jì)以來，隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，基因工程被引入功能菌的構(gòu)建，而基因過表達(dá)技術(shù)便是利用基因工程進(jìn)行代謝改造的重要手段之一。

基因過表達(dá)技術(shù)是將含有目的基因的編碼區(qū)拼接至相應(yīng)的載體中，上調(diào)表達(dá)目的基因，使目的基因被過度轉(zhuǎn)錄、翻譯，從而提高目標(biāo)蛋白或目標(biāo)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量的一門技術(shù)[4]，具有效率高、易操作、專一性強(qiáng)等特點(diǎn)[5]。將改造的功能菌投入食品行業(yè)，對于延長食品的保藏期，改善和增強(qiáng)食品的色、香、味及提高食品發(fā)酵效率等具有重要價值[6]。從發(fā)展戰(zhàn)略來看，挖掘潛力之大，確有廣闊的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)前景。

1 基因過表達(dá)在食品領(lǐng)域中的研究

食品發(fā)酵過程難以控制，多菌系發(fā)酵體系還會造成菌種間的拮抗作用，生成代謝副產(chǎn)物，外加一些菌株的功能基因表達(dá)水平低、耐受性差等問題，都在一定程度上限制著食品企業(yè)的發(fā)展[7]。基因過表達(dá)技術(shù)的出現(xiàn)無疑為解決上述問題提供了突破性的思路和強(qiáng)有力的手段。微生物擁有豐富的酶資源，對酶資源的開發(fā)和利用尤為重要。利用該技術(shù)提高酶活性，可為食品行業(yè)提供性能優(yōu)良的工程菌?？v觀大量研究報道發(fā)現(xiàn)，基因過表達(dá)技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用主要表現(xiàn)在增加目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量、增強(qiáng)野生菌株適應(yīng)環(huán)境能力等方面。

1.1 增加目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量

如今，防腐劑、著色劑、食用香料等食品添加劑已活躍于各類食品加工場所，大大促進(jìn)了食品工業(yè)的發(fā)展，現(xiàn)代食品產(chǎn)業(yè)對其需求量也日愈增加。然而近年來發(fā)生的一些食品安全事故都與食品添加劑有關(guān)，導(dǎo)致人們對食品添加劑的安全性關(guān)注度逐漸提高[8]。利用生物工程技術(shù)制備天然綠色食品添加劑已成為現(xiàn)今的研究方向，這不僅能夠解決資源短缺問題，也符合當(dāng)前的消費(fèi)潮流，引導(dǎo)食品產(chǎn)業(yè)升級[9]。

1.1.1 食品防腐劑

在食品防腐劑方面，乳酸鏈球菌素（nisin）是一種常見的具有較強(qiáng)殺菌能力的天然食品防腐劑，由乳酸鏈球菌發(fā)酵提取而得，在英國用于食品防腐已有50多年的歷史，常用于乳制品、肉制品、罐頭食品的質(zhì)保[10]。在野生乳酸鏈球菌N8中過表達(dá)調(diào)控乳酸鏈球菌素合成的相關(guān)基因如磷酰基載體蛋白基因ptsh[11]、6-磷酸果糖激酶基因pfk及蛋白激酶催化亞基基因pkac[12]，能夠提高乳酸鏈球菌素的產(chǎn)量。納他霉素作為一種高效、安全的食品防腐劑，已被廣泛應(yīng)用于奶酪、肉制品、果汁飲料等領(lǐng)域，被美國、南美、歐盟等30多個國家批準(zhǔn)作為食品防腐劑使用[13]。將納他霉素生物合成基因簇中的特異性調(diào)控基因pimM、膽固醇氧化酶基因pimE導(dǎo)入褐黃孢鏈霉菌中過表達(dá)，可使納他霉素產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了17.77%和19.56%[14]。

1.1.2 食品著色劑

在食品著色劑方面，靛藍(lán)是一種安全的食用色素，在食品呈色中起重要作用。據(jù)文獻(xiàn)報道，假單胞菌屬[15]、紅球菌屬[16]及不動細(xì)菌屬[17]等微生物中含有加氧酶或羥化酶，是生物合成靛藍(lán)色素的優(yōu)勢微生物。通過篩選高產(chǎn)靛藍(lán)色素的野生假單胞菌B4，并擴(kuò)增其中的苯乙烯單加氧酶基因styab，與表達(dá)載體pBK-CMV連接后轉(zhuǎn)化至原宿主表達(dá)，能夠較好地提高天然靛藍(lán)色素的產(chǎn)量[18]。

1.1.3 食用香料

食用香料常用來配制食用香精或直接給食品加香，利用基因工程技術(shù)研究生產(chǎn)天然香料已備受香料界的關(guān)注[19]。2-苯乙醇具有玫瑰香氣，常作為食用香精為面包、啤酒等食品增香。酵母菌是其生物合成主要微生物，其中的脫羧酶基因ARO是關(guān)鍵合成基因?？寺RO10基因并構(gòu)建重組質(zhì)粒后導(dǎo)入釀酒酵母S288C中過表達(dá)，可使轉(zhuǎn)化菌的2-苯乙醇的質(zhì)量濃度提高至1.0 g/L，較原始菌提高16%[20]。在釀酒酵母W303-1B中同時過表達(dá)脫羧酶基因ARO80、ARO9和ARO10基因，能使2-苯乙醇產(chǎn)量較原始菌提高3.1倍[21]。乙偶姻具有令人愉快的奶油香味，常用于配制奶香型、草莓香型香精或直接用于奶制品增香，枯草芽孢桿菌是其生物合成的重要微生物[22]。在枯草芽孢桿菌JNA 3-10中分別過表達(dá)α-乙酰乳酸合成酶基因alsS和α-乙酰乳酸脫羧酶基因alsD，可使乙偶姻產(chǎn)量較野生菌提高5.2%和4.1%[23]。

1.1.4 白酒酯類

構(gòu)建高產(chǎn)酯類的釀酒酵母并用于白酒生產(chǎn)是基因過表達(dá)技術(shù)的另一研究熱點(diǎn)[24]。中國白酒中酯含量較低，僅達(dá)到2%左右，釀酒酵母的產(chǎn)酯能力也極低，難以大量合成酯類物質(zhì)，這些問題已長期困擾我國白酒界[25]。將高產(chǎn)酯類工程菌用于白酒釀造，不僅能提高單位時間內(nèi)的產(chǎn)酯量，縮短發(fā)酵周期，減少糧耗，還能取代產(chǎn)酯微生物窖泥，避免窖泥微生物發(fā)酵產(chǎn)生異味物質(zhì)。目前，已有大量關(guān)于提高濃香型白酒中己酸乙酯主體香含量的研究報道。研究者們通常選取磷酸甘油酸激酶基因pgk1作為上游調(diào)控元件，在其控制下過表達(dá)醇己酰基轉(zhuǎn)移酶基因eht1、乙酰輔酶A羧化酶基因acc1、脂肪酸合成酶1基因fas1及脂肪酸合成酶2基因fas2，將代謝通路定向至脂肪酸的合成，提高己酸乙酯的產(chǎn)量，促進(jìn)果香形成[26-27]。李鋒等[28]曾在釀酒酵母AY15中過表達(dá)eht1，使己酸乙酯產(chǎn)量提高為原菌種的2.21倍，辛酸乙酯和癸酸乙酯含量也分別提高了31.4%和49.1%。盡管目前鑒于食品安全問題，釀酒行業(yè)尚未將基因工程菌應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，但工程菌的潛在價值是不可否認(rèn)的。如何在安全規(guī)范、避免危害的前提下應(yīng)用它，是進(jìn)一步的研究方向。

1.2 增強(qiáng)野生菌株適應(yīng)環(huán)境能力

食品發(fā)酵對微生物菌種有嚴(yán)格要求，微生物對發(fā)酵環(huán)境如溫度、pH、鹽分的適應(yīng)能力是決定其能否成功投入工業(yè)化生產(chǎn)的重要因素。一些野生菌為了適應(yīng)極端環(huán)境，往往會在其細(xì)胞內(nèi)形成多種具有特殊功能的酶，這對食品發(fā)酵生產(chǎn)是十分有用的?；蜻^表達(dá)技術(shù)可以提高功能酶基因在菌株基因組中的占比，增加特定酶的產(chǎn)量，促進(jìn)菌株適應(yīng)環(huán)境。

1.2.1 耐高溫

醋酸菌在釀造食醋風(fēng)味形成方面具有突出作用，其最適發(fā)酵溫度為30 ℃，夏季高溫會嚴(yán)重影響發(fā)酵速率。近年來，日本等國成功利用基因工程技術(shù)改良醋酸菌的耐高溫特性[29]。據(jù)報道，熱休克蛋白dnaK能在調(diào)節(jié)蛋白dnaJ的協(xié)助下耐高溫脅迫[30-31]，啟動子groESL易調(diào)控，在熱誘導(dǎo)條件下能加速轉(zhuǎn)錄。通過過表達(dá)dnaK、dnaJ及groESL基因，可以增強(qiáng)醋酸菌對高溫的耐受性，即使在42 ℃高溫條件下也能正常生長。

1.2.2 耐酸

在食醋釀造過程中，醋酸菌的耐酸能力直接影響其生產(chǎn)效果。高酸度的釀造醋不僅能夠節(jié)省儲存空間，方便食品加工業(yè)使用，還能在一定程度上抑制雜菌污染，減少生產(chǎn)損耗。醋酸菌發(fā)酵過程中的乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）與其耐酸性呈正相關(guān)，在醋酸菌中過表達(dá)ALDH酶基因，能夠提高菌種的耐酸性，最高耐酸度可達(dá)到98.6 g/L[32]。SHIGERU N等[33]研究發(fā)現(xiàn)，醋酸菌細(xì)胞膜中的蛋白質(zhì)AatA是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的一員，對醋酸、蟻酸、檸檬酸等具有耐性。通過在醋化桿菌中過表達(dá)aata基因，使工程菌在90.0 g/L時產(chǎn)平均酸速率較導(dǎo)入前40.0 g/L時速率幾乎相同，可以實(shí)現(xiàn)醋酸菌的耐高酸，并保持穩(wěn)定的產(chǎn)酸速率。

1.2.3 耐鹽

耐鹽微生物在醬腌菜、調(diào)味品、肉的腌制品等鹽漬食品中應(yīng)用得較多，通過正常的發(fā)酵作用，能抑制有害微生物的活動而起到防腐作用。食品中常見的耐鹽微生物有魯氏酵母菌、球擬酵母菌及葡萄球菌[34]等。魯氏酵母中的Na+/H+-反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ZrSOD2與細(xì)胞膜H+-ATP酶基因ZrPMA1二者在耐鹽性中起到明顯的協(xié)同作用。構(gòu)建含ZrSOD2和ZrPMA1基因的表達(dá)載體，導(dǎo)入釀酒酵母中過表達(dá)，能賦予酵母穩(wěn)定的耐鹽性[35]。將具有耐鹽功能的大麥水通道蛋白基因HvPIP2;5和鋅指蛋白基因oslol5擴(kuò)增后分別連接至質(zhì)粒pYES2，并轉(zhuǎn)化至酵母菌中，均可增強(qiáng)其在高鹽滲透條件下的耐受性[36-37]。

2 工程菌的安全性及轉(zhuǎn)基因食品檢測技術(shù)

隨著人們生活水平的提升，食品安全問題備受關(guān)注，尤其是各國多年來頻繁出現(xiàn)許多食品安全事件，使得轉(zhuǎn)基因食品的安全性引起大家的爭議。雖然截止目前還未有實(shí)例報道工程菌在食品行業(yè)應(yīng)用上存在明顯的危害性，但從理論角度出發(fā)，無論是技術(shù)性還是工業(yè)生產(chǎn)性，在一定程度上均存在一些弊端。在技術(shù)上，目的基因的過量引入可能會引起轉(zhuǎn)錄缺陷，激活其他代謝途徑，造成菌株惡性突變，在投入食品發(fā)酵過程中生成有毒、有害或其他引起食品變質(zhì)的物質(zhì)，嚴(yán)重?fù)p害食品質(zhì)量，或是可能在融入食品后進(jìn)入人體，對人體組織、細(xì)胞造成嚴(yán)重危害[38]。在工業(yè)生產(chǎn)上，工程菌屬于外源菌種，參與食品發(fā)酵可能會破壞原始菌群結(jié)構(gòu)的平衡，對發(fā)酵環(huán)境造成不可修復(fù)的破壞。因此，采取有效的食品安全檢測技術(shù)對于保障食品安全、人體健康及降低對食品發(fā)酵環(huán)境的影響極其重要。

目前，常用于檢測轉(zhuǎn)基因食品的技術(shù)有單管巢式和半巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)[39]、環(huán)介導(dǎo)溫擴(kuò)增法[40]、液相芯片技術(shù)[41]及試劑條法[42]等。ZHOU D G等[43]運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)溫擴(kuò)增法檢測轉(zhuǎn)基因甘蔗中的cry1Ac基因，結(jié)果最低檢出限為1.0 ng/μL。FU K等[44]對13種轉(zhuǎn)基因玉米品系進(jìn)行多重PCR-液相芯片檢測，結(jié)果靈敏度達(dá)到0.1%，且探針和引物之間特異性較高。我國中科院生物技術(shù)研究所也研制出金杯免疫檢測試紙條[45]，可快速檢測轉(zhuǎn)基因植物中的Bt-Cry1Ab蛋白和Bt-Cry1Ac蛋白。

可見，無論是檢測效率、靈敏度還是適用范圍，轉(zhuǎn)基因食品檢測技術(shù)的發(fā)展都邁向了新臺階。科技在不斷進(jìn)步，技術(shù)在日益更新。相信在科研工作者孜孜不倦的研究下，基因過表達(dá)技術(shù)的弊端會逐漸減少，檢測技術(shù)會更加快速準(zhǔn)確，以確保轉(zhuǎn)基因食品的質(zhì)量安全。

3 展望

具有特征功能的野生菌株是發(fā)酵食品行業(yè)的珍稀資源，但自身功能基因表達(dá)水平低、耐受性差等問題一直阻礙著人們對其的開發(fā)利用。而基因過表達(dá)技術(shù)在改良微生物菌種方面的能力非常突出，給多樣的菌種世界帶來了無限的可能性，它不僅能解決食品行業(yè)資源不足的問題，為食品的色、香、味和貯藏提供有力保障，還能提高耐受性基因在菌株基因組中的占比，實(shí)現(xiàn)工程菌的“身強(qiáng)體壯”，更好地滿足食品行業(yè)的生產(chǎn)需求。在一定程度上，野生菌株與基因過表達(dá)技術(shù)之間彰顯出較好的適配性，無論是菌株資源的充分利用，還是生物技術(shù)的強(qiáng)效運(yùn)用，都是推動社會工業(yè)化發(fā)展的潤滑劑。

但是，由于人們對野生菌株的功能特性、生理生化特性及毒理學(xué)特性認(rèn)知不全，基因過表達(dá)技術(shù)對于食品領(lǐng)域而言也存在安全性質(zhì)疑，兩者結(jié)合是否會出現(xiàn)1＋1＞2的安全問題還需要更多的實(shí)踐證明。如何正確對待這些問題，關(guān)鍵是要將爭議擱置，在篩選野生菌株時做好全面細(xì)致的生理生化試驗與毒理學(xué)試驗，充分發(fā)揮基因過表達(dá)技術(shù)在微生物資源改造和利用方面的優(yōu)勢，不斷挖掘利用轉(zhuǎn)基因食品檢測技術(shù)，制定完善的食品法律法規(guī)條例，使基因過表達(dá)技術(shù)和食品行業(yè)同步發(fā)展，才能更好的造福于人類，加速食品工業(yè)現(xiàn)代化進(jìn)程。