新建輔助生殖實(shí)驗(yàn)室的鼠胚培養(yǎng)質(zhì)控及鼠卵顯微注射分析

柳嵐，吳兵平，李志敏，林華，李勵(lì)軍

（莆田學(xué)院附屬醫(yī)院，莆田 351100）

近年來，不孕不育患者呈逐年增加的趨勢(shì)，大部分患者需要借助輔助生殖技術(shù)（ART）治療實(shí)現(xiàn)成功受孕。人類輔助生殖實(shí)驗(yàn)室是精卵結(jié)合和胚胎發(fā)育的場(chǎng)所，培養(yǎng)室的環(huán)境、培養(yǎng)體系及技術(shù)人員操作水平直接關(guān)系到 ART技術(shù)的成功與否［1－2］。作為新建輔助生殖實(shí)驗(yàn)室，在開展人類ART技術(shù)之前，有必要對(duì)整個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行全面地分析評(píng)估。研究表明，小鼠體外受精法和體內(nèi)受精法胚胎培養(yǎng)可以很好地檢測(cè)新建輔助生殖實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)控情況［3－4］。并且通過鼠胚實(shí)驗(yàn)合理評(píng)估實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)系統(tǒng)的同時(shí)，可以提高技術(shù)人員的操作水平，為順利開展人類IVF、ICSI技術(shù)提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和質(zhì)量控制保證。鼠卵是比較理想的ICSI模型，然而采用人ICSI操作系統(tǒng)進(jìn)行鼠卵ICSI時(shí)效果不佳，卵子存活率低下，且鼠精的特殊結(jié)構(gòu)使得顯微注射操作相對(duì)困難［5－7］。為此，本研究分析比較了常規(guī)人卵顯微注射模式與鼠斷尾精子顯微注射模式的結(jié)局，探討鼠卵ICSI操作對(duì)新建輔助生殖實(shí)驗(yàn)室顯微注射技術(shù)質(zhì)控的意義。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明小鼠購自北京華阜康生物科技有限公司，雌鼠6～10周齡，雄鼠10周齡以上。分10個(gè)批次進(jìn)行鼠胚實(shí)驗(yàn)，每批次5只雌鼠，2只雄鼠。

2．藥物與試劑：注射用血清促性腺激素（PMSG）購自寧波三生藥業(yè)有限公司，HCG購自馬鞍山豐原制藥廠。主要試劑采用美國COOK商品化培養(yǎng)液，培養(yǎng)液使用前1d配制好，配子緩沖液置37℃培養(yǎng)箱中平衡過夜，受精培養(yǎng)液、卵裂胚培養(yǎng)液、囊胚培養(yǎng)液置37℃、6%CO2培養(yǎng)箱中平衡過夜。

3．主要耗材與設(shè)備：培養(yǎng)皿、四孔板、圓底管等均為美國Falcon公司產(chǎn)品；顯微注射針（SIC－50W－30）、顯微固定針（SHP－100－30）購自美國Sunlight Medical公司；以及德國Labotect培養(yǎng)箱、丹麥L－126MP工作站、日本Nikon顯微操作系統(tǒng)等。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1．實(shí)驗(yàn)分組：按照授精方式的不同，將小鼠分為體內(nèi)受精組和體外受精組，每組每批次各促排2只雌鼠；并且按照ICSI操作的具體方法不同，將獲得的卵母細(xì)胞分為常規(guī)人卵顯微注射模式（C－ICSI組）和鼠斷尾精子顯微注射模式（D－ICSI組），每組每批次促排1只雌鼠，所獲得的卵母細(xì)胞脫顆粒細(xì)胞后用于顯微注射。

2．小鼠超排卵：健康雌鼠于下午17時(shí)腹腔內(nèi)注射PMSG（10U／只），48h后腹腔內(nèi)注射 HCG（10U／只）。

3．體內(nèi)受精組：注射HCG后雌鼠與雄鼠1∶1合籠，次日8∶00am觀察合籠雌鼠陰道栓情況，將有陰道栓的雌鼠頸椎脫臼法處死，打開腹腔取出卵巢及輸卵管，洗滌去除血跡，體視鏡下用1ml注射器輕輕劃破輸卵管壺腹部，收集合子團(tuán)（即聚集成堆的受精卵）。將收集的合子團(tuán)置于透明質(zhì)酸酶中，去除卵丘顆粒細(xì)胞后計(jì)數(shù)受精卵和未受精卵子數(shù)量，進(jìn)行微滴培養(yǎng)觀察。

4．體外受精組：次日8∶00am頸椎脫臼法處死未合籠的健康雌鼠，打開腹腔取出卵巢及輸卵管，洗滌去除血跡，體視鏡下用1ml注射器輕輕劃破輸卵管壺腹部，收集卵子團(tuán)。雄鼠處死，取出附睪及輸精管，洗滌去除血跡，體視鏡下用1ml注射器劃破輸精管，釋放鼠精，上游法處理精子懸液。將精子懸液加入卵子團(tuán)的受精四孔板中，調(diào)整精子濃度為1×106／ml，4～5h短時(shí)受精后收集受精卵進(jìn)行微滴培養(yǎng)觀察。

5．ICSI：卵子團(tuán)置于透明質(zhì)酸酶中去除卵丘顆粒細(xì)胞后，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中孵育，待ICSI操作。安裝顯微注射針和固定針，準(zhǔn)備ICSI操作皿，顯微注射針吸取制動(dòng)鼠精或鼠斷尾精子頭，固定針固定卵子（第一極體位于6點(diǎn)或12點(diǎn)），精子推至注射針尖處，3點(diǎn)處垂直穿過透明帶并繼續(xù)水平進(jìn)針，至卵胞漿中心或越過中心位置，回吸注射針至可見卵膜回彈快速返流時(shí)，將精子注入卵胞質(zhì)中，退針，收集存活卵子進(jìn)行微滴培養(yǎng)觀察。C－ICSI組：即注射針在鼠精尾部中段輕壓，迅速回拉注射針劃破精子尾部制動(dòng)；D－ICSI組：即顯微注射針壓住鼠精頸部，朝精子頭方向刮動(dòng)使鼠精斷尾。

6．胚胎觀察：體內(nèi)受精的合子團(tuán)于透明質(zhì)酸酶消化處理后，觀察原核胚數(shù)；體外受精、ICSI的于受精4～6h后觀察原核胚數(shù)。第1天（D1）觀察2－細(xì)胞數(shù)，D2觀察4－細(xì)胞，D3觀察8－細(xì)胞／致密化8－細(xì)胞數(shù)，D5觀察囊胚形成數(shù)。參照之前文獻(xiàn)方法統(tǒng)計(jì)受精率、卵裂率和囊胚形成率［8］。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0．05時(shí)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、小鼠胚胎的培養(yǎng)觀察

小鼠卵子正常受精后，受精卵內(nèi)可見雌、雄原核形成，為原核期胚胎（圖1A）；隨后進(jìn)入卵裂期，第1次卵裂可見2個(gè)大小均一、無碎片的卵裂球，為2－細(xì)胞胚胎（圖1B）；受精第2天可見4個(gè)大小均一、無碎片的卵裂球，為4－細(xì)胞胚胎（圖1C）；受精第3天可見8個(gè)大小均一的卵裂球或致密化后緊密聯(lián)系在一起的8個(gè)卵裂球，為8－細(xì)胞／致密化8－細(xì)胞胚胎（圖1D）；受精第5天可見囊胚腔形成、透明帶變薄，分化為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外細(xì)胞層，部分囊胚進(jìn)入孵化階段，為囊胚期胚胎（圖1E）。

圖1 不同發(fā)育階段的小鼠胚胎（×200）

二、體內(nèi)受精法和體外受精法胚胎培養(yǎng)的質(zhì)控結(jié)果

共進(jìn)行10個(gè)批次的鼠胚質(zhì)控分析，體內(nèi)受精法獲卵642枚，受精590枚，卵裂556枚，囊胚478枚；體外受精法獲卵630枚，受精514枚，卵裂480枚，囊胚392枚。體內(nèi)受精組的受精率顯著高于體外受精組（91．90%vs．81．59%，P＜0．001）。兩組的卵裂率（94．24%vs．93．39%）、囊胚形成率（85．97%vs．81．67%）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）（表1）。

三、兩種鼠卵顯微注射方法結(jié)局比較

人卵顯微注射系統(tǒng)應(yīng)用于鼠ICSI時(shí)卵子存活率有降低的趨勢(shì)，但C－ICSI組與D－ICSI組的卵子存活率比較尚沒有顯著性差異（29．49%vs．30．52%，P＞0．05）。顯微注射后的存活胚胎繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)觀察，相比于C－ICSI組，D－ICSI組的受精率（56．72%vs．42．53%）、卵 裂 率 （71．05%vs．43．24%）及囊胚形成率（61．11%vs．31．25%）顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）（表2）。

表1 體內(nèi)受精法和體外受精法胚胎發(fā)育情況的比較 （%）

表2 兩種顯微注射方法存活率及存活胚胎發(fā)育情況的比較（%）

討 論

由于小鼠胚胎與人胚胎有著幾乎相同的發(fā)育經(jīng)歷，鼠胚培養(yǎng)成為檢測(cè)人早期胚胎體外發(fā)育環(huán)境的最佳模式，是目前最常用的生殖實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制方法［1，9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示體內(nèi)受精法和體外受精法的囊胚形成率均達(dá)80%，符合輔助生殖實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。兩種受精方法的效果略有不同，體內(nèi)受精法的受精率高的原因可能是體內(nèi)受精的卵母細(xì)胞處在穩(wěn)定的母體環(huán)境中，無需面臨溫度、滲透壓、PH等變化的應(yīng)激反應(yīng)［10－11］。

從體內(nèi)受精、體外受精胚胎發(fā)育結(jié)局看，兩種受精方法均保持了較高的卵裂率和囊胚形成率，二者均能夠很好地檢測(cè)輔助生殖實(shí)驗(yàn)室的穩(wěn)定情況。以上結(jié)果表明，作為新建的輔助生殖胚胎實(shí)驗(yàn)室，我們的培養(yǎng)體系、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員操作水平已達(dá)標(biāo)，可以為順利開展人類IVF技術(shù)提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和質(zhì)量控制保證。

目前，對(duì)于新建輔助生殖實(shí)驗(yàn)室ICSI技術(shù)的質(zhì)量控制尚無代表性的動(dòng)物模型。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為鼠卵體積小且具有易脆性，完全按照常規(guī)人卵顯微注射模式操作，鼠卵損傷嚴(yán)重，注射部位卵膜不易恢復(fù)，卵膜易崩解死亡［12］。1995 年，Kimura等［13］借助Piezo儀器產(chǎn)生的高頻振動(dòng)進(jìn)行透明帶、卵膜穿入進(jìn)行鼠卵ICSI后，鼠卵的存活率得以顯著提高，Wakayama等［14］將該技術(shù)成功應(yīng)用于鼠核移植及其干細(xì)胞建系，小鼠存活率可達(dá)94%～100%，然而Piezo－ICSI技術(shù)與人卵ICSI技術(shù)差別極大，無法完全模擬人卵ICSI技術(shù)，不能代表人卵ICSI技術(shù)水平。非Piezo－ICSI技術(shù)的發(fā)展，尤其是兩步法非Piezo－ICSI技術(shù)［7，15］采用改良的喇叭形固定針對(duì)鼠卵先淺吸持后淺穿刺，再進(jìn)一步深吸持并深穿刺，控制卵膜凹陷變形、破膜及其修復(fù)過程中的關(guān)鍵因素，提高了鼠卵的存活率。上述兩種鼠卵顯微注射模式可以獲得較好結(jié)局，但顯然與常規(guī)人卵顯微注射模式不同，且其安全性尚需進(jìn)一步研究。

作為新建的輔助生殖實(shí)驗(yàn)室，為保證人類ICSI技術(shù)的順利開展，不考慮改變常規(guī)人卵顯微注射模式的操作練習(xí)。從胚胎發(fā)育的結(jié)局上分析，C－ICSI時(shí)的鼠卵子存活率僅30%左右，且受精率、卵裂率及囊胚形成率均較低。該組胚胎培養(yǎng)觀察時(shí)，原核期僅小部分胚胎見雌、雄原核，另一小部分胚胎可見異常卵裂現(xiàn)象，推斷此部分胚胎為孤雌激活現(xiàn)象，顯微注射時(shí)引發(fā)的鈣離子震蕩導(dǎo)致鼠卵孤雌激活的概率增高，而并非精子進(jìn)入卵子后的正常發(fā)育過程。為排除ICSI操作技術(shù)上的因素，我們考慮是否因?yàn)槭缶Y(jié)構(gòu)上的差異，采用人精制動(dòng)、注射模式并不能有效激活鼠卵母細(xì)胞，鼠精與人精的明顯區(qū)別在于鼠精頭部呈勾形、尾部長且硬，為此引入D－ICSI組，直接顯微注射入鼠精頭。相比于C－ICSI組，D－ICSI組的受精率、卵裂率及囊胚形成率顯著升高，鼠精斷尾方式有效改善人卵ICSI操作系統(tǒng)應(yīng)用于小鼠實(shí)驗(yàn)的結(jié)局，但并不提高鼠卵存活率。

綜上所述，昆明小鼠配子體外受精法和體內(nèi)受精法均有較高的囊胚形成率，達(dá)到輔助生殖胚胎實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。人卵顯微注射系統(tǒng)應(yīng)用于鼠卵ICSI時(shí)，由于鼠與人的卵子、精子結(jié)構(gòu)上的差異，不應(yīng)成為新建輔助生殖實(shí)驗(yàn)室ICSI技術(shù)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，而僅適用于卵子顯微注射操作練習(xí)。通過鼠胚實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)體系的穩(wěn)定性，為順利開展人類IVF、ICSI技術(shù)提供了技術(shù)保障。