NIMA相關(guān)蛋白激酶7、Nod樣受體蛋白3與多囊卵巢綜合征炎癥指標(biāo)相關(guān)性研究

王耀琴，許素銘，齊改梅，畢星宇，李艷宏，張新，武學(xué)清

（山西省兒童醫(yī)院 山西省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，太原 030013）

多囊卵巢綜合征（PCOS）是育齡期婦女常見的內(nèi)分泌紊亂型疾病，常伴隨有肥胖、血脂異常、胰島素抵抗及慢性炎癥。研究指出，大部分PCOS患者由于外周血中炎性因子［C反應(yīng)蛋白（CRP）、白細(xì)胞介素－1β（IL－1β）、IL－18、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、單核細(xì)胞趨化蛋白－1（MCP－1）、可溶性細(xì)胞間黏附分子（sICAM）和可溶性內(nèi)皮白細(xì)胞黏附分子（sE－selectin）等］高表達，使PCOS機體處于慢性炎癥狀態(tài)［1］。另外，有研究顯示PCOS卵巢功能異常的病理改變與炎性細(xì)胞在卵巢中的侵潤和慢性炎癥有關(guān)［2－4］。因此，研究炎癥對PCOS發(fā)生發(fā)展的作用至關(guān)重要。

目前，Nod樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體激活機制是大家關(guān)注的熱點。NLRP3炎性小體識別病原體相關(guān)分子模式，活化半胱氨酸蛋白酶－1（caspase－1），導(dǎo)致IL－1β和IL－18的成熟和分泌，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［5－6］。2016年有研究顯示，NIMA相關(guān)蛋白激酶7（NEK7）是NLRP3炎性小體激活過程必需的調(diào)節(jié)物質(zhì)［7－8］。NEK7 作為NLRP3炎性復(fù)合體參與炎性小體的激活，調(diào)節(jié)炎性疾病的進展。研究顯示，鉀離子外流激活NEK7，調(diào)節(jié)NLRP3的寡聚化和激活，而NEK7一旦沉默，NLRP3炎性小體（包括NLRP3、caspase－1和IL－1β）表達則被抑制［9］。更為重要的是，NEK7作為一個細(xì)胞開關(guān)，在細(xì)胞周期有絲分裂和炎癥小體的激活中起著重要的作用［5］。因此，NEK7可能成為炎癥疾病治療和預(yù)防的新靶點。

盡管關(guān)于NEK7和NLRP3調(diào)節(jié)關(guān)系的研究受到廣泛關(guān)注，但到目前為止，針對PCOS中NEK7／NLRP3炎性小體激活關(guān)系的研究甚少。本研究旨在通過檢測PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞中NEK7、NLRP3在mRNA水平表達量的變化，探討其與PCOS各指標(biāo)的相關(guān)性和預(yù)測價值，為PCOS慢性炎癥的治療及預(yù)防提出新策略。

資料和方法

一、研究對象

選取2018年8月至2019年3月于山西省兒童醫(yī)院／山西省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的PCOS患者為研究組（n＝30），選擇同期非PCOS不孕患者為對照組（n＝34）。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者簽署知情同意書。

研究組納入標(biāo)準(zhǔn)：PCOS患者均符合鹿特丹診斷標(biāo)準(zhǔn)，即：（1）稀發(fā)排卵或不排卵；（2）高雄或高雄激素血癥；（3）卵巢的多囊樣改變（卵巢存在≥12個直徑2～9mm的卵泡或卵巢體積＞10cm3）。至少符合其中2項，并除外3個月內(nèi)接受過促排卵治療，曾接受過放化療治療或卵巢手術(shù)，合并子宮內(nèi)膜異位癥、先天性腎上腺增生、庫欣綜合征、垂體腫瘤或糖尿病等。

對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）因男方因素或輸卵管因素不孕就診的患者；（2）月經(jīng)周期規(guī)則；（3）內(nèi)分泌激素水平正常；（4）無發(fā)熱及炎癥性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均排除吸煙、飲酒、最近6個月內(nèi)服用影響炎癥反應(yīng)的藥物及其他炎癥性疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、高血壓、潰瘍性結(jié)腸炎或惡性血液系統(tǒng)疾病等。

二、方法

1．促排卵方案：根據(jù)每個患者自身情況綜合評估，定期監(jiān)測卵泡大小和血清LH、E2水平，并調(diào)整用藥，進行促排卵。當(dāng)B超監(jiān)測到至少3個卵泡直徑≥18mm時，于當(dāng)日注射HCG（珠海麗珠醫(yī)藥）5 000～10 000U，36h后經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵。

2．基礎(chǔ)性激素水平檢測：月經(jīng)來潮的第2～3天，空腹抽取患者靜脈血，采用化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法（自動酶聯(lián)免疫分析儀AIA－2 000ST，日本東曹株式會社）進行性激素（PRL、LH、FSH、E2、P 和 T）測定。

3．卵巢顆粒細(xì)胞及卵泡液上清液的收集：參照前期發(fā)表文章［10］收集卵巢顆粒細(xì)胞冷凍保存用于實時定量PCR（qPCR）檢測，并收集離心所得卵泡液上清，用于后續(xù)酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測炎癥因子IL－1β和IL－18的表達。

4．NEK7和NLRP3mRNA表達量的檢測：參照EZNA 提取試劑盒（OMEGA，美國）說明書操作，提取卵巢顆粒細(xì)胞總RNA，檢測RNA濃度與純度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物）將1μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物用于qPCR擴增，引物退火溫度為60℃，擴增循環(huán)設(shè)定為40個循環(huán)，GAPDH作為內(nèi)參，采用2－△△Ct計算mRNA的相對表達量，引物序列見表1所示。

表1 實時定量PCR引物序列及產(chǎn)物長度

5．炎癥相關(guān)指標(biāo)檢測：應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物）檢測卵泡液上清中炎癥相關(guān)指標(biāo)IL－1β、IL－18的表達水平，操作按試劑盒說明書要求進行。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS 19．0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（珔x）表示，并采用獨立樣本t檢驗；各因素間關(guān)系分析采用Spearman相關(guān)性分析；應(yīng)用ROC曲線分析NEK7、NLRP3的診斷效能；以P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組患者的一般資料及促排卵實驗室指標(biāo)比較

本研究共納入64例患者，研究組30例，對照組34例。兩組間年齡、不孕年限、月經(jīng)初潮年齡、基礎(chǔ)FSH、E2、P水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05），而研究組的BMI、基礎(chǔ)LH、LH／FSH和T顯著高于對照組（P＜0．05）；促排卵實驗室指標(biāo)比較顯示，兩組的MⅡ卵率和受精率比較無顯著性差異（P＞0．05），研究組的獲卵數(shù)顯著高于對照組（P＜0．05）（表2）。

二、兩組患者卵泡液中炎癥相關(guān)因子的表達比較

結(jié)果顯示，研究組卵泡液中炎癥因子IL－1β的表達水平［（3．43±0．50）pg／ml］顯著高于對照組［（1．17±0．11）pg／ml］（P＝0．000 1），研 究 組IL－18的表達水平［（143．6±26．32）pg／ml］顯著高于對照組［（56．35±3．61）pg／ml］（P＝0．002 4）（圖1）。

表2 兩組患者一般臨床資料及促排卵指標(biāo)比較（x ）

表2 兩組患者一般臨床資料及促排卵指標(biāo)比較（x ）

注：與對照組比較，＊P＜0．05，＃P＜0．001

組 別 例數(shù) 年齡 不孕年限 初潮年齡 BMI（kg／m2）基礎(chǔ)LH（U／L）基礎(chǔ)FSH（U／L） LH／FSH對照組 34 30．03±0．82 4．69±0．56 13．65±0．26 22．37±0．45 5．35±0．56 8．66±0．41 0．64±0．06研究組 30 29．40±0．68 4．55±0．59 13．43±0．24 26．10±0．64＃ 8．30±0．94＊ 8．22±0．48 1．19±0．18＊組 別 例數(shù) 基礎(chǔ)E2（pmol／L）基礎(chǔ)P（nmol／L）基礎(chǔ)T（nmol／L） 獲卵數(shù) MⅡ卵率 受精率對照組 34 302．06±17．57 1．87±0．35 1．36±0．11 17．59±1．76 0．79±0．04 0．84±0．03研究組 30 295．98±35．58 2．00±0．22 1．79±0．18＊ 25．40±2．73＊ 0．80±0．04 0．87±0．03

圖1 兩組卵泡液中炎癥因子IL－1β、IL－18的表達水平比較

三、卵巢顆粒細(xì)胞中NEK7及NLRP3mRNA的相對表達量比較

研究組患者卵巢顆粒細(xì)胞中NEK7及NLRP3 mRNA的表達量均顯著高于對照組［分別為（1．39±0．17）vs．（0．94±0．13）；（1．70±0．26）vs．（1．06±0．10）］（P＜0．05）（圖2）。

四、顆粒細(xì)胞中NEK7、NLRP3mRNA表達量與各指標(biāo)的相關(guān)性分析

將研究組患者顆粒細(xì)胞中NEK7、NLRP3mRNA表達量分別與各指標(biāo)進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明顆粒細(xì)胞NEK7、NLRP3mRNA表達水平與基礎(chǔ)LH、LH／FSH 及炎癥因子IL－1β、IL－18呈顯著正相關(guān)（P＜0．05）（表3）。

圖2 兩組卵巢顆粒細(xì)胞中NEK7和NLRP3mRNA表達水平比較

表3 顆粒細(xì)胞中NEK7、NLRP3mRNA表達與PCOS指標(biāo)的相關(guān)性

五、NEK7和NLRP3mRNA對PCOS的診斷價值

ROC曲線對比分析顯示，NEK7mRNA水平診斷PCOS的AUC為0．741，NLRP3mRNA診斷PCOS的AUC為0．694，而二者聯(lián)合診斷PCOS的AUC為0．728，且均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。但NEK7和NLRP3mRNA的聯(lián)合使用并不能有效增加對PCOS的診斷價值（圖3、表4）。

圖3 ROC曲線分析

表4 各指標(biāo)應(yīng)用于PCOS診斷的ROC曲線統(tǒng)計描述

討 論

PCOS是臨床常見的導(dǎo)致排卵障礙性不孕的主要原因，臨床特征主要表現(xiàn)為：稀發(fā)排卵或不排卵、高雄和／或高雄激素血癥和卵巢的多囊樣改變。PCOS病因?qū)W復(fù)雜，目前認(rèn)為慢性炎癥也是影響PCOS的一個重要因素。有研究指出高雄激素下，PCOS患者胰島素受體信號通路與炎性因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相互影響［11］，刺激卵巢內(nèi)炎癥因子IL－6、TNF－α分泌，造成卵巢組織慢性炎癥，引起卵泡閉鎖和退化過程受阻，最終導(dǎo)致排卵障礙和囊狀卵泡形成［3，12］。PCOS患者常伴有糖耐量異常，增加了脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致患者氧化應(yīng)激水平升高，而卵巢組織氧化應(yīng)激又可引起卵泡細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，從而導(dǎo)致卵巢功能紊亂［13］。慢性炎癥和胰島素抵抗又可進一步加劇PCOS的病理進程［14］。因此，研究PCOS慢性炎癥的發(fā)生與發(fā)展至關(guān)重要。

然而，PCOS的炎癥機制目前尚未完全清楚。NLRP3炎癥小體是由胞內(nèi)固有免疫受體NLRP3、接頭蛋白ASC和半胱氨酸蛋白酶caspase－1作為核心組成的多蛋白復(fù)合物，誘導(dǎo)炎癥因子IL－1β和IL－18的成熟和分泌，從而促進炎癥的發(fā)生，而NLRP3炎癥小體的激活需要NEK7的參與。目前關(guān)于NEK7及NLRP3在PCOS低度慢性炎癥中的炎癥激活通路的研究尚未見報道。在本研究中，我們利用qPCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)研究組患者卵巢顆粒細(xì)胞中NEK7及NLRP3在mRNA水平表達量增加。

此外也有證據(jù)表明，通過體外受精（IVF）助孕的患者其炎癥因子不僅影響卵母細(xì)胞的受精，而且與妊娠能否成功密切相關(guān)［15］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)研究組卵泡液中炎癥因子IL－1β和IL－18高表達。IL－1β是NLRP3炎癥小體激活的下游關(guān)鍵效應(yīng)分子，影響系統(tǒng)或局部炎癥反應(yīng)，IL－1β和TNF－α共同參與免疫和炎癥反應(yīng)［16］。有研究報道IL－1β和TNF－α是影響排卵和妊娠成功的重要標(biāo)記物［17］。炎性小體信號通路中另一個炎癥因子IL－18，可被半胱氨酸蛋白酶caspase－1激活并釋放［18］。IL－18是一個多功能炎癥因子，在對抗宿主感染中起重要防御作用，在卵泡液中有顯著表達［19］。有研究顯示，取卵日血清中高水平的IL－18可能預(yù)示PCOS和卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生，而低水平的IL－18被發(fā)現(xiàn)是不明原因不孕的一個特征［20－21］。以上結(jié)果提示我們，PCOS卵巢顆粒細(xì)胞中NEK7及NLRP3的高表達可能促進卵泡液中炎癥因子IL－1β和IL－18的釋放，導(dǎo)致PCOS患者出現(xiàn)低度慢性炎癥。本研究中相關(guān)性研究結(jié)果顯示，NEK7及NLRP3mRNA表達水平與炎癥因子IL－1β、IL－18呈顯著正相關(guān)，進一步證明了NEK7與NLRP3炎癥小體激活通路在PCOS炎癥發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮一定作用。

另外，相關(guān)性研究結(jié)果顯示NEK7及NLRP3與LH和LH／FSH呈顯著正相關(guān)，提示NEK7及NLRP3可能與PCOS的發(fā)生相關(guān)。對此我們進行ROC曲線分析，研究結(jié)果顯示NEK7mRNA水平對PCOS具有良好的診斷價值，而二者聯(lián)合應(yīng)用并不能有效增加對PCOS的診斷價值。

綜上，PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞中NEK7及NLRP3在mRNA水平高表達，其可能通過激活炎性小體信號通路，促進炎癥因子IL－1β、IL－18的釋放，導(dǎo)致PCOS慢性炎癥。同時NEK7對PCOS具有良好診斷價值，提示NEK7可能作為PCOS的治療靶點，為PCOS的治療提供新思路。