關(guān)于PCR技術(shù)應(yīng)用的研究綜述

蔣汶潔 王威

【摘要】PCR技術(shù)即聚合酶鏈式反應(yīng)，是一種在體外酶促合成特定基因或DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，因其靈敏、快速、簡便、特異性強等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域。本文闡述了PCR技術(shù)的原理、發(fā)展歷程及其在口岸傳染病檢測、保護瀕危野生鳥類等不同領(lǐng)域中的應(yīng)用。PCR 技術(shù)雖應(yīng)用廣泛，但其發(fā)展和運用受到多種因素的影響，利用實驗室的質(zhì)量控制手段來保證檢測結(jié)果能從根本上減少誤差產(chǎn)生的概率，從而為PCR技術(shù)應(yīng)用的準確檢出提供有力的保證。

【關(guān)鍵詞】PCR技術(shù);傳染病檢測;食品檢測

一、PCR技術(shù)的原理

PCR技術(shù)即“聚合酶鏈式反應(yīng)”，是一種在體外模擬發(fā)生在細胞內(nèi)的DNA快速擴增特定基因或DNA序列的復(fù)制過程的技術(shù)，從而滿足對核酸的體外研究和應(yīng)用。一般情況下，PCR由以下3個基本反應(yīng)所組成：一、高溫變性即加熱待擴增的DNA樣品及反應(yīng)體系，使雙鏈DNA變成單鏈模板DNA;二、低溫退火即降低反應(yīng)溫度，使引物與兩條單鏈模板發(fā)生退火作用，并結(jié)合在靶DNA區(qū)段兩端的互補序列的位置上;三、適溫延伸即將反應(yīng)體系的溫度上升到72℃保溫數(shù)分鐘，在DNA聚合酶的作用下，dNTPs分子便將引物的3'端加入并沿著模板DNA分子按5'到3'方向延伸，合成新的DNA互補鏈。如此反復(fù)加溫冷卻，短短數(shù)分鐘就可以把目標DNA進行多次擴增，只要有足夠的DNA聚合酶和足夠的4種脫氧核苷三磷酸，PCR反應(yīng)的全過程就可以不斷的循環(huán)重復(fù)。

二、PCR技術(shù)的發(fā)展歷程

1953 年，沃森和克里克發(fā)表的DNA雙螺旋模型標志著分子生物學(xué)的誕生，這一成果也被譽為20世紀以來生物學(xué)方面最偉大的發(fā)現(xiàn)。在了解了DNA分子的結(jié)構(gòu)后，人類就在一直探索研究DNA的新方法、新技術(shù)。

1971年，Khorana成功合成了丙氨酸t(yī)RNA的編碼基因，他是第一個成功完成基因合成的人。Khorana等人最早提出PCR理論即DNA變性解鏈后與相應(yīng)引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。但因當時基因序列分析方法尚未成熟、熱穩(wěn)定DNA聚合酶還未發(fā)現(xiàn)及寡聚核苷酸引物合成仍處于手工和半自動階段，所以，DNA體外擴增技術(shù)并未獲得全面推廣。

1985年，Mullis等用大腸桿菌DNA聚合酶Kleenow片段體外擴增哺乳動物單拷貝基數(shù)成功，1985年10月25日申請了PCR的專利，1987年7月28日批準（專利號4683，202），Mullis是第一發(fā)明人，至此，PCR技術(shù)首次被提出，Mullis闡述了具有劃時代意義的PCR技術(shù)，其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是需要在試管中提供體外合成DNA所需要的合適的條件，例如，模板DNA，寡核苷酸引物，dNATP，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的時間和溫度。當時Mullis所使用的大腸桿菌聚合酶1片段Klenow存在一些缺陷，Klenow酶不耐熱，在對DNA模板進行熱變性時，會導(dǎo)致此酶的鈍化，因此每完成一個擴增周期就需要增加一次酶，同時比較耗時、費力、易出錯。但1988年初，Keohanog改用T4aDNA聚合酶進行PCR技術(shù)，提高了被擴增DNA片段的均一性。

1988年，Saiki等人在黃石公園溫泉中分離的一株嗜熱桿菌中提取到了一種耐高溫DNA聚合酶，該酶耐高溫的性質(zhì)使其在熱變性時不會被鈍化，將其運用于PCR技術(shù)，則不必在每次擴增反應(yīng)后再添加新酶，從而極大地提高了PCR擴增的效率。Tap酶的發(fā)現(xiàn)，使得PCR真正變?yōu)楝F(xiàn)實，為其自動化鋪平了道路。

1989年，美國“Science”雜志將PCR技術(shù)列為十余項重大科學(xué)發(fā)明之首，將熱穩(wěn)定DNA聚合酶命名為“年度分子”。1993年，凱利.穆利斯（Kary Banks Mullis）博士因PCR技術(shù)榮獲諾貝爾化學(xué)獎。

PCR技術(shù)現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)學(xué)、植物病理學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域的研究。最初的PCR技術(shù)相當不成熟，但在隨后的幾十年里，PCR技術(shù)被不斷改進，它從一種定性的分析方法發(fā)展到定量測定;從原先只能擴增幾個KB的基因到目前已能擴增長達幾十個kb的DNA片斷。短短幾十年，該技術(shù)已經(jīng)成為最常用也最重要的分子生物學(xué)技術(shù)之一，其應(yīng)用范圍從基本的基因擴增，擴展到基因克隆、基因改造、傳染病源分析、遺傳指紋鑒定等，甚至擴展到許多非生物領(lǐng)域。

三、PCR技術(shù)的應(yīng)用

3.1 PCR技術(shù)在口岸傳染病檢測中的應(yīng)用

我國國境口岸重大傳染病疫情防控是國家傳染病防控不可或缺的一個環(huán)節(jié)，通過內(nèi)防輸入和外防輸出遏制疫情是海關(guān)衛(wèi)生檢疫部門的責任，其中，傳染病檢測實驗室是保障口岸傳染病檢出的不可或缺的后備檢測力量。

PCR技術(shù)即聚合酶鏈式反應(yīng)，因其靈敏、快速、簡便、特異性強等特點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于多種疫源性疾病的診斷、疫情研判及感染來源等領(lǐng)域。比如將C-PCR技術(shù)應(yīng)用于甲型流感病毒的檢測、熒光定量RT-PCR技術(shù)應(yīng)用于中東呼吸綜合征冠狀病毒的檢測、微滴式數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)用于新型冠狀病毒中的檢測。

PCR 技術(shù)的建立為傳染病檢測提供了快速、靈敏及特異的實驗室篩查與確診手段，可以及時為傳染病確診提供檢測依據(jù)，能夠進一步提高口岸傳染病檢測的應(yīng)對與防控能力，PCR這種基因擴增技術(shù)因其簡單易行，應(yīng)用已極為廣泛，

3.2 PCR技術(shù)在保護瀕危野生鳥類中的應(yīng)用

近年來，由于環(huán)境污染，植被破壞等因素導(dǎo)致許多珍稀野生鳥類瀕臨滅絕。為了更好地保護鳥類，必須采取一定的措施來提高它們的繁殖率，對這些珍稀野生鳥類進行人工繁育和遷地保護將發(fā)揮非常重要的作用。全世界的鳥類中，絕大部分鳥類是單態(tài)性鳥類，即雌雄同型，它們的個體無論是處在幼體還是成體時期，都很難從外觀上和行為上將其區(qū)分開來，所以鳥類的性別早期鑒定對鳥類的人工飼養(yǎng)管理、繁育、疾病防治等方面都存在重要的意義。

我們基于CHD 基因的分子生物學(xué)方法，能夠較為準確快速地鑒定出麥哲倫企鵝的性別，對提高館養(yǎng)麥哲倫企鵝的人工繁殖率和飼養(yǎng)管理水平，以及進一步研究保護瀕危野生鳥類具有重要的意義。

利用PCR擴增與同源性比對分析相結(jié)合的方法來對瀕危鳥類進行性別鑒定。選用合適的引物擴增出瀕危鳥類的 CHD 基因，對擴增后的PCR產(chǎn)物進行 CHD 基因序列的Blast比對與同源性分析，成功鑒定出了瀕危鳥類的性別。與其他鳥類性別鑒定方法相比，該方法采用PCR技術(shù)，利用穩(wěn)定遺傳的基因DNA，解決了兩者基因大小差別不大造成難以準確判定的困難，從而不依賴于較難區(qū)別的外部形態(tài)，結(jié)果更可靠，而且對于剛出生的鳥類也同樣適用，這種方法可以實現(xiàn)對性別的早期鑒定，而且操作簡便，周期短，可以同時檢測大量的樣品，是到目前為止最為簡單快捷、準確可靠的鳥類性別鑒定的途徑。

3.3 PCR技術(shù)在豬病診斷和防治中的應(yīng)用

隨著生豬養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；图s化發(fā)展，豬病的種類越來越多，嚴重影響我

國生豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，豬病種類在不斷增加的同時，關(guān)于豬病的診斷和防治技術(shù)也在進步，其中就包括 PCR 檢測技術(shù)，該技術(shù)能夠?qū)δ承┴i病作出準確的判斷，進一步保證檢測的準確性和快速性。另外，針對混合型病癥，可以利用多重 PCR 檢測技術(shù)，該技術(shù)的靈敏性比較強，準確性高，在診斷的過程中可以節(jié)省大量的時間，能夠為后期及時有效的治療和防治疾病奠定基礎(chǔ)，從而減少了養(yǎng)殖者所承擔的經(jīng)濟風(fēng)險，促進我國生豬養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

在該技術(shù)實際應(yīng)用的過程中，主要有以下幾個方面的優(yōu)點。首先，操作性較強，技術(shù)能夠簡單的應(yīng)用于實際的工作中;其次，高效的擴增結(jié)果，能夠?qū)崿F(xiàn)成果的轉(zhuǎn)化;最后，特異性較高，技術(shù)性較強?，F(xiàn)階段，該技術(shù)能夠在很短的時間內(nèi)實現(xiàn)快速擴張的形勢使微量基因得到快速的檢測。

3.4 動物疫病中多重PCR技術(shù)的應(yīng)用

隨著我國生物技術(shù)的不斷進步，多重 PCR 技術(shù)也開始應(yīng)用于動物疫病的診斷，該技術(shù)可以一次性對多種疾病加以鑒定，促使動物疫病的診斷水平上升到了分子水平，而且具有的優(yōu)勢非常明顯。

多重 PCR 技術(shù)在動物疫病診斷中主要是應(yīng)用于以下四個方面：1、應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查。我國動物易發(fā)的疾病非常多，但在流行病學(xué)調(diào)查的過程中發(fā)現(xiàn)，豬鏈球菌的檢測是比較重要的，將多重 PCR 技術(shù)應(yīng)用在豬鏈球菌的檢測方面，可以檢測出多個血清類型的豬鏈球菌，從而更好地了解疾病流行病學(xué)，控制疫病的發(fā)生和發(fā)展。2、應(yīng)用于類癥鑒別。養(yǎng)雞場比較容易爆發(fā)呼吸道傳染病，并且感染源眾多。場內(nèi)不同日齡雞群的易感性存在差異。這些疾病是具有很高的發(fā)病率和死亡率，給動物飼養(yǎng)帶來相當高的危險性。由于動物感染的多種疾病都有比較相似的癥狀，在解剖學(xué)的角度分析并不能加以區(qū)分，而且在實際的檢測過程中會受到許多因素的干擾，操作也相對麻煩，所以將多重 PCR 技術(shù)引入，可以有效實現(xiàn)對該類傳染病病原的檢測過程。3、應(yīng)用于病原微生物的分型鑒定。根據(jù)相關(guān)專家的實驗結(jié)果顯示可知，根據(jù)引物對不同亞型病原微生物的 cDNA 片段反應(yīng)不同，表現(xiàn)出將多重 PCR 技術(shù)應(yīng)用于微生物分型鑒定中，具有科學(xué)性和臨床可行性。4、應(yīng)用于動物寄生蟲病的診斷。由于在實際臨床中針對動物疫病的檢查方式有限，對反芻動物胃腸道中寄生蟲的診斷效果非常的不理想，動物感染寄生蟲病之后，采用常規(guī)的檢測方式通過不容易鑒別不同寄生蟲的感染。采用常規(guī)的觀察方法以及蟲卵的檢測結(jié)果，都不能夠很好的保證結(jié)果的準確性，從而對臨床動物疫病產(chǎn)生比較嚴重的影響。因此將多重 PCR 技術(shù)應(yīng)用于動物寄生蟲病的診斷過程，確保了檢測的準確性。

3.5 PCR技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用

在社會不斷進步以及人們安全意識不斷提高的時代背景下，對于食品安全問題的關(guān)注度一直居高不下。通過有關(guān)數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，因食品安全問題導(dǎo)致的重大事故甚至死亡案件在不斷增多，這就要求我國必須具備更為完善的檢測技術(shù)，如何提高檢測技術(shù)水平減少食品安全問題的產(chǎn)生，也是廣大專家學(xué)者一直非常關(guān)注的問題。

食品微生物的種類很多，在一個食品中也存在很多微生物，用傳統(tǒng)的方法檢測食品中的微生物需要分離微生物，而且一些微生物難以檢測出來。另外，在傳統(tǒng)的食品微生物檢測中，通常都需要耗費非常大的精力，因為操作比較繁瑣，而且檢測方式的自動化程度也較低，需要觀察菌落的特征以及生化反應(yīng)的特點等，比較瑣碎。但是，應(yīng)用 PCR 檢測食品微生物，不僅非常方便簡單，而且可以準確的檢測出食品中的微生物，精確度非常高。

通過應(yīng)用PCR技術(shù)，可以檢測食源性病菌即食品中的大腸桿菌、沙門氏菌等細菌，從而降低人們受到病菌侵害的概率。 同時，還可以對食品成分進行檢測，可以對肉質(zhì)類食品進行動物成分檢測，因此相關(guān)部門可以利用這一特性，進行重點研究和發(fā)展，加強對市場的檢測，避免出現(xiàn)假冒偽劣產(chǎn)品。PCR技術(shù)還可以用來鑒定轉(zhuǎn)基因食品，隨著時代以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)基因食品現(xiàn)在已經(jīng)廣泛出現(xiàn)在人們的生活中，食品行業(yè)應(yīng)該加強對 PCR 技術(shù)的研究和運用，重點對轉(zhuǎn)基因食品進行定性或定量分析，以促進社會生活的穩(wěn)定發(fā)展。比如轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因水稻等。最后，利用 PCR 技術(shù)能夠有效了解食品中的價值，PCR 技術(shù)作為食品檢測的關(guān)鍵技術(shù)，能夠檢測食品中的有效成分，有效保證包裝上信息的準確性，從而保證消費者的知情權(quán)。

四、PCR技術(shù)所存在的問題

PCR 這種基因擴增技術(shù)因其簡單易行，應(yīng)用已極為廣泛，但其發(fā)展和運用受很多因素的影響，例如 PCR 儀設(shè)計原理上的差異和經(jīng)常出現(xiàn)的溫控不準等質(zhì)量問題，離心機的質(zhì)量或使用不正確造成離心標本模板沒有被完整分離，在臨床標本核酸提取過程中，靶核酸的丟失和提取試劑的殘留，擴增儀孔間溫度差異，標本中抑制物的去除不徹底，以及標本或核酸純化過程中出現(xiàn)的擴增反應(yīng)抑制物等問題都會影響最后的結(jié)果。同時，由于 PCR 技術(shù)對所檢測的核酸模板進行大量擴增，在得到極大檢測靈敏度的同時，對檢測中的錯誤也有極大的放大作用，還可能因?qū)嶒炇椅廴径玫藉e誤的結(jié)果。目前，PCR 技術(shù)最容易產(chǎn)生檢測誤差的環(huán)節(jié)在于標本采集的準確性、核酸樣本的純化、試劑改進、人員操作等方面。因此，把控好核酸提取試劑的標準化，以及傳染病實驗室檢測程序的規(guī)范化，盡量能從根本上減少誤差產(chǎn)生的概率，從而為傳染病的準確檢出提供有力的保證。