肥桃流膠病病原鑒定

呂孟轅彭騁張東劉洪明何邦令劉會(huì)香

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/山東省林業(yè)有害生物防控工程技術(shù)研究中心，山東泰安 271018；2.泰安市泰山景區(qū)桃花峪管理區(qū)，山東泰安 271000）

肥桃Prunus persica‘Feicheng'是山東省肥城市乃至全國(guó)獨(dú)特的桃品種，是中國(guó)水果名優(yōu)特產(chǎn)之一。種植面積達(dá)到了近7 000 hm2，年產(chǎn)量1.6 億公斤，經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益顯著。近幾年來(lái)，肥桃流膠病發(fā)生嚴(yán)重，對(duì)肥桃的生產(chǎn)、銷售造成了極大影響。

多數(shù)學(xué)者認(rèn)為桃樹流膠病是生理現(xiàn)象，屬于非侵染性病害[1]。20 世紀(jì) 70 年代，Weaver 第 1 次分離出Botryosphaeria dothidea，人們才發(fā)現(xiàn)真菌可導(dǎo)致桃樹流膠病的發(fā)生[2]。1863 年葡萄座腔菌屬才被正式定義[2]。在上海、廣州、湖北等南方桃產(chǎn)區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)Physalospora persicae[3]、Botryosphaeria dothidea[4]、Cucurbitaria[5]、Leptosphaeria[5]等屬真菌也導(dǎo)致桃流膠病。多種報(bào)道認(rèn)為葡萄座腔菌屬真菌Botryosphaeriaspp.可引起桃流膠病[6-9]。B.dothidea進(jìn)入寄主組織可通過(guò)皮孔，氣孔或樹皮上小的傷口途徑侵入[10]。大量研究表明，溫度、濕度是影響桃流膠病發(fā)生的重要因素[11]，氣溫高、降雨量大是春夏桃流膠暴發(fā)的主要原因，入冬后，低溫、少雨等因素抑制病害發(fā)生[12-17]。

筆者首次對(duì)肥城桃樹流膠病的發(fā)病情況進(jìn)行了全面調(diào)查，通過(guò)大量樣本采集和分離鑒定明確了肥桃流膠病病原的分類地位，以期為肥桃流膠病的科學(xué)防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)方法

1.1.1 發(fā)病情況調(diào)查 2017 年9 月在肥城市的西尚里村、東尚里村、劉臺(tái)村景區(qū)、南尚里村和桃園鎮(zhèn)肥桃種植區(qū)5 個(gè)主要肥桃產(chǎn)區(qū)中選取多年生桃樹，每個(gè)肥桃產(chǎn)區(qū)按照東南北四個(gè)方位分別選取4 個(gè)桃園，每個(gè)方位的桃園選取15 棵樹勢(shì)相似、栽培條件相同的桃樹進(jìn)行桃流膠病的發(fā)病率及發(fā)病程度的調(diào)查與統(tǒng)計(jì)。每次每個(gè)種植區(qū)調(diào)查60 株，計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。

發(fā)病率（%） =發(fā)病總株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100

病情指數(shù) = ∑（各級(jí)病株數(shù) × 相應(yīng)病級(jí)值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高病級(jí)值） ×100

桃流膠病發(fā)病程度的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，參考羅江會(huì)[1]制定的桃流膠病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

表1 桃流膠病病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 The classification standard of peach gummosis disease

1.2 樣本采集 2016—2018 年共6 次在山東省肥城市的西尚里村、東尚里村、劉臺(tái)村景區(qū)和南尚里村、桃園鎮(zhèn)肥桃種植區(qū)5 個(gè)主要肥桃產(chǎn)區(qū)，分別選取典型桃園內(nèi)5 個(gè)采樣點(diǎn)的不同方位（東、南、西、北、中），采用隨機(jī)取樣的方法，在每個(gè)桃園采集5 組具有典型癥狀的病枝，共計(jì)125 個(gè)病枝作為試驗(yàn)材料并編號(hào)。

1.3 病原菌的分離與純化 采用組織分離法進(jìn)行病原菌分離[18]。每個(gè)病枝分離25 個(gè)病健交界組織，放置于 PDA 平板放入28 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)[19]。5 d 后，觀察病組織分離情況，統(tǒng)計(jì)微生物的種類和數(shù)量。將上述分離的微生物，按照不同類型進(jìn)行純化培養(yǎng)，獲得單一的微生物。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 培養(yǎng)特性觀察 分離純化的菌株繼續(xù)在28 ℃下培養(yǎng)。觀察記錄菌絲形態(tài)、菌落邊緣特征、菌落顏色變化特征。

1.4.2 形態(tài)學(xué)特性觀察 供試菌株在PDA 培養(yǎng)基上觀察其子實(shí)體大小、顏色等形態(tài)，顯微鏡下觀察病菌分生孢子器和分生孢子大小、形狀和顏色等形態(tài)，分別測(cè)定100 個(gè)分生孢子器和分生孢子。

1.4.3 ITS 序列鑒定 采用2 ×CTAB 法進(jìn)行基因組的 DNA 提取，采用引物 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′） 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增[20]，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，將上述所獲得的PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后送公司測(cè)序，獲得的序列與GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)菌株進(jìn)行比對(duì)，用MEGA5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)ITS 基因序列數(shù)據(jù)進(jìn)行NJ（Neighbor Joining）分析，以啟發(fā)式搜索獲得系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定病原菌種類和分類地位。

1.5 致病性測(cè)定 從7 種類型的分離菌株中各挑選1 個(gè)典型菌株分離純化后，選取3 個(gè)菌株重復(fù)，按照柯赫氏法則，分別接種到與分離物來(lái)源一致的肥城紅里桃2 a 生健康枝條上，7 d 后確定分離物致病性。采用離體刺傷接種法。剪取紅里肥桃15 cm 長(zhǎng)的2 a生枝條，用清水沖洗后用75 %酒精進(jìn)行表面消毒，無(wú)菌水漂洗3 次后用吸水紙吸干水分；用無(wú)菌針在枝條中間部位針刺5 針，將準(zhǔn)備好的菌絲塊接種于傷口處，以PDA 瓊脂塊同樣處理接種為對(duì)照；于25 ℃條件下培養(yǎng)。測(cè)量7 d 時(shí)枝條病斑長(zhǎng)度，比較不同分離菌株的致病力大小，根據(jù)柯赫氏法則，對(duì)枝條發(fā)病病斑進(jìn)行再分離，觀察分離得到的病菌是否與原接種菌株相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 肥桃流膠病發(fā)病情況 基于2017 年對(duì)5 個(gè)主要肥桃產(chǎn)區(qū)的肥桃流膠病田間癥狀調(diào)查，肥城市肥桃流膠病發(fā)生較為嚴(yán)重，肥城桃產(chǎn)區(qū)平均發(fā)病率為61.77%，最高發(fā)病率 88.0%；平均病情指數(shù)為24.9，最高病情指數(shù)為26.9（表2）。

表2 肥城市各桃園肥桃流膠病發(fā)病率和病情指數(shù)Tab.2 Incidence rate and disease index of peach tree gummosis disease in Feicheng city

2.2 肥桃流膠病病原鑒定

2.2.1 采集分離純化獲得的病原菌株 2016—2018 年通過(guò)對(duì)125 個(gè)病枝分離純化后共獲得160個(gè)菌株，根據(jù)培養(yǎng)特征分為7 個(gè)類型，其分離純化結(jié)果見表3。類型1 和類型4 是病斑上分離到的優(yōu)勢(shì)菌株，其他菌株是偶發(fā)的菌株。

2.2.2 病斑分離物菌落培養(yǎng)特性

類型1 菌株生長(zhǎng)較為旺盛，菌落生長(zhǎng)速度快，菌絲呈棉絮狀；中部菌絲較外緣菌絲旺盛，菌絲初為白色，后由中心向四周輻射狀變黑；最終整個(gè)菌落呈現(xiàn)墨黑色。

表3 肥桃流膠病菌株分離結(jié)果Tab.3 Isolation result of pathogen from peach gummosis spots

類型2 菌株菌絲生長(zhǎng)相對(duì)平緩，菌落扁平；菌絲初為白色后顏色逐漸變深直至變?yōu)楹谏?/p>

類型3 菌株菌絲生長(zhǎng)非常旺盛，后期菌絲可生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿頂端，整個(gè)菌落呈棉絮狀，菌絲顏色變化為先白后黑。

類型4 菌株菌絲生長(zhǎng)平緩，呈絨毛狀，菌絲初為白色，后逐漸呈輻射狀變紅，直至整個(gè)菌落呈磚紅色。

類型5 菌株菌絲白色，生長(zhǎng)平緩；外圍菌絲較內(nèi)部菌絲旺盛。

類型6 菌株菌絲白色，匍匐，中部菌絲比四周菌絲生長(zhǎng)旺盛。

類型7 菌株菌絲疏松、生長(zhǎng)旺盛，菌落外圍一圈菌絲生長(zhǎng)旺盛，菌絲顏色初為白色，后逐漸變?yōu)闇\紅色。

7 個(gè)類型菌株的培養(yǎng)菌落形態(tài)見圖1。

圖1 肥桃流膠病病斑分離物菌落培養(yǎng)特征Fig.1 Culture characteristics of strains isolated from peach gummosis disease spots

2.2.3 病斑分離物的形態(tài)學(xué)特性 顯微鏡下，部分菌株的子實(shí)體形態(tài)見圖2；7 種類型菌株的分生孢子形態(tài)見圖3；7 種類型菌株的分生孢子器和分生孢子形態(tài)描述如表4。

圖2 肥桃流膠病病斑分離菌株子實(shí)體形態(tài)學(xué)特征Fig.2 Morphological characteristics of fruiting body of strains isolated from peach gummosis disease spots

圖3 肥桃流膠病病斑分離菌株分生孢子形態(tài)學(xué)特征Fig.3 Morphological characteristics of conidiospore of isolated strains from peach gummosis disease spots

表4 肥桃流膠病病斑分離物形態(tài)學(xué)特征Tab.4 Morphological characteristics of strains isolated from peach gummosis disease spots

2.2.4 病原菌分子鑒定 從分離菌株的rDNA-ITS的PCR 擴(kuò)增、BLAST 序列比對(duì)結(jié)果（圖4）可以看出類型1（菌株 T1、T9、T15、T16、T19、T22）與Botryosphaeria dothidea序列相似性100%；類型2（菌株L11） 與Lasiodiplodia theobromae的序 列 相 似性98%；類型3（菌株T7）與B.obtusa（無(wú)性態(tài)為Diplo-dia seriata） 的序列相似性 99%；類型 4 （菌株F27-2、F8-2）與Fusarium lateritium的序列相似性100%；類型5（菌株F11-3）與F.fujikuroi的序列相似性100%；類型 6（菌株 F3-3、F44-2、F13-2、F39-3）與F.proliferatum的序列相似性100%；類型7（菌株F38-2）與F.oxysporum序列相似度100%。

圖4 基于rDNA-ITS 序列的桃樹流膠病病原菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on rDNA-ITS sequence of isolated strains of peach gummosis disease spots

2.2.5 病原菌致病性 所有接種菌株均能引致枝條病斑出現(xiàn)。接種后48 h 就有水漬狀病斑產(chǎn)生，圓形至橢圓形，隨時(shí)間推移病斑由淺褐色變?yōu)楹稚?，且逐漸向四周擴(kuò)展，病斑出現(xiàn)凹陷及流膠（圖5）。

圖5 肥桃流膠病斑分離物接種健康枝條發(fā)病癥狀Fig.5 Symptoms of peach gummosis disease using isolated strains inoculation in healthy shoot

對(duì)發(fā)病枝條的病斑處進(jìn)行再分離及鑒定，均可獲得與原接種菌株一致的病原菌，因此確定T1 菌株（B.dothidea）、T7 菌株（B.obtusa）、L11 菌株（Lasiodiplodia theobromae）、F8-2 菌株（F.lateritium）、F44-2 菌株（F.proliferatum）、F11-3 菌株（F.fujikuroi）和 F38-2 菌株（F.oxysporum）均可致肥桃流膠病發(fā)生，即B.dothidea、B.obtusa、Lasiodiplodiae theobroma、F.proliferatum、F.fujikuroi、F.oxysporum與F.lateritium7 種病原菌為肥城桃流膠病的病原菌。表5 也表明不同接種菌株致病力有差異，綜合以上結(jié)果Botryosphaeria dothidea和Fusarium lateritium是引起肥桃流膠病的優(yōu)勢(shì)病原。

表5 接種7 d 后肥桃流膠病病斑代表分離菌株的致病性測(cè)定Tab.5 Lesion diameters in shoots inoculated with seven strains seven days after inoculation

3 討論與結(jié)論

綜合肥桃流膠病病斑分離物的培養(yǎng)學(xué)、形態(tài)學(xué)、ITS 序列及致病力測(cè)定，明確了肥桃流膠病可由7種真菌引起，包括B.dothidea、B.obtusa、Lasiodiplodia theobromae、F.proliferatum、F.fujikuroi、F.oxysporum與F.lateritium，其中B.dothidea和F.lateritium是優(yōu)勢(shì)種，其他均是偶發(fā)種，這7 種病原菌間的互作及其與肥桃流膠病的關(guān)系，尚需繼續(xù)研究。

本研究中共分離出鐮孢菌類菌株4 種，為F.proliferatum、F.fujikuroi、F.oxysporum與F.lateritium，在肥桃流膠病病原研究中，這是首次發(fā)現(xiàn)鐮孢菌類真菌為致病菌。F.lateritium分離率最高，為優(yōu)勢(shì)病原菌。但在鐮孢菌類菌株致病性測(cè)定試驗(yàn)中，F(xiàn).lateritium的致病力卻最低。F.fujikuroi與F.proliferatum的致病性差異不大，明顯高于F.lateritium與F.oxysporum兩類菌株。但鐮孢菌種類病原菌無(wú)論分離率還是致病性均低于葡萄座腔菌。

本實(shí)驗(yàn)中，鐮孢菌類菌株的分離比率明顯低于葡萄座腔菌菌株，并且在分離過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，鐮孢菌類菌株與葡萄座腔菌菌株全部相伴而生，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)鐮孢菌類菌株單獨(dú)被分離的現(xiàn)象，由此推論葡萄座腔菌類菌株是肥桃流膠病主要病原菌，鐮孢菌類菌株是伴生病原菌，可混合侵染危害。