展穎野生稻單片段代換系芽期耐Cd材料篩選及QTL鑒定

王璋強，李蕊芯，陸怡，楊帆，劉田田，何平，張鴻興，熊毅，傅雪琳,2

(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東廣州510642；2廣東省植物分子育種重點實驗室，廣東廣州510642；3華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510642)

近年來，在我國經(jīng)濟迅速發(fā)展的過程中，礦山開采和工業(yè)廢物等帶來的土壤和環(huán)境重金屬污染日益嚴(yán)重，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人們的身體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。其中，重金屬Cd 是毒性很強的環(huán)境污染物，通過空氣沉降、灌溉和施肥等途徑進入土壤，引起土壤污染。土壤中高含量Cd 對植物的毒性主要表現(xiàn)為植物褪綠、壞疽、落葉、生長量減少、根伸長受阻等[1]。Cd 污染農(nóng)業(yè)環(huán)境后會不同程度地影響水稻生長及籽粒Cd 含量，由此對以稻米為食的人們的生活與健康造成嚴(yán)重危害，如20世紀(jì)60年代日本稻田Cd 污染導(dǎo)致的骨痛病。水稻在各個生長階段都會受到土壤中Cd 的脅迫，正常的生長發(fā)育受到嚴(yán)重影響。水稻種子萌發(fā)過程中，Cd 對種子發(fā)芽率影響較小，但會顯著抑制胚根及胚芽的生長，對胚根的抑制作用明顯大于胚芽[2-4]。水稻幼苗期遭受Cd 脅迫后，根系生長受到抑制，苗高和根長增長減慢[5]。水稻籽粒Cd 積累在不同品種間存在顯著差異，研究發(fā)現(xiàn)了控制籽粒Cd 積累的主效基因[6-7]。籽粒低Cd 積累是水稻耐Cd 研究的重點，從水稻育種和生產(chǎn)需要來看，各個生育時期均耐Cd 的材料是最理想的材料。因此，前期耐Cd 性與籽粒低Cd 積累的相關(guān)性研究有助于早期篩選籽粒低Cd 積累的材料。程旺大等[8]利用苗期耐Cd 性和籽粒Cd 含量差異明顯的4個晚粳稻品種研究了Cd 脅迫對水稻生長和營養(yǎng)代謝的影響，發(fā)現(xiàn)Cd 脅迫下各品種的產(chǎn)量、每株穗數(shù)、每穗粒數(shù)、結(jié)實率、粒質(zhì)量及地上部干物質(zhì)質(zhì)量等顯著降低，苗期耐Cd 性強的品種受到的抑制作用小于耐Cd 性弱的品種，耐性相近的品種中，籽粒Cd 富集程度較高的品種也嚴(yán)重受害。該研究預(yù)示可以探索用苗期耐Cd 性評價不同品種籽粒Cd 含量的差異。

水稻耐Cd 性是多基因控制的數(shù)量性狀，在耐Cd 種質(zhì)資源篩選、QTL定位、耐Cd 基因克隆與功能等研究方面已取得一定進展[6-7,9-21]，上述研究有助于解析水稻耐Cd 性的遺傳控制基因及作用機理，為育種改良水稻耐Cd 性提供重要的指導(dǎo)依據(jù)。野生稻是栽培稻的祖先，在長期自然進化過程中適應(yīng)了多種自然環(huán)境，積累了較強的抗逆性，是天然的基因庫[22]。但是目前野生稻耐Cd 性研究的報道還較少。廣東省植物分子育種重點實驗室前期構(gòu)建了以展穎野生稻Oryza glumaepatula為供體的染色體單片段代換系(Single-segment substitution lines,SSSLs)文庫[23]，本研究對部分SSSLs在芽期進行了不同濃度CdCl2溶液的脅迫處理，對發(fā)芽第7天的種子根長及芽長進行分析，以相對根長與相對芽長為指標(biāo)，篩選出多份芽期耐Cd 性強的SSSLs，并根據(jù)代換片段的信息，進行初步的QTL鑒定分析。本研究有助于擴大水稻耐Cd 資源的范圍，獲得新的優(yōu)異基因，為水稻耐Cd 育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

栽培稻品種‘華粳秈74’、‘新黃占’、‘中花11’、‘臺中65’、‘粵晶絲苗2號’和‘象牙香占’用于確定芽期耐Cd 試驗中Cd 溶液處理濃度與培養(yǎng)條件及Cd 耐性分析指標(biāo)。以‘華粳秈74’為受體、展穎野生稻IRGC104387為供體構(gòu)建的SSSLs材料共37份。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子發(fā)芽試驗與處理方法挑選穎殼光亮、大小均勻、無斑點、飽滿無損傷的水稻種子，用蒸餾水洗滌1遍后用70%(φ)乙醇溶液浸泡20 s，倒去乙醇溶液，用蒸餾水洗去殘留的乙醇溶液，重復(fù)3次，用培養(yǎng)皿法進行發(fā)芽試驗。栽培稻品種試驗中，CdCl2濃度設(shè)為0(對照，只加蒸餾水)、30、50、100和500μmol·L?1。根據(jù)栽培稻品種的濃度梯度的試驗結(jié)果，將野生稻SSSLs CdCl2處理濃度設(shè)為0(對照，只加蒸餾水)、50、100μmol·L?1。每個培養(yǎng)皿放置20～30粒種子，1個培養(yǎng)皿為1次重復(fù)，每份材料每個濃度重復(fù)3次。浸種時，在各培養(yǎng)皿中加入相同體積蒸餾水或CdCl2溶液以淹沒種子，放在(25±1)℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察，待露白后，將露白的種子轉(zhuǎn)移到墊有2層無菌濾紙的培養(yǎng)皿中。每天補充處理溶液，保持濾紙濕潤。每日光照/黑暗時間設(shè)為16/8 h，光照強度為5 000 lx。

1.2.2 水稻幼苗形態(tài)指標(biāo)的測量以胚芽達到種子長度一半作為發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)。于發(fā)芽后第7天統(tǒng)計發(fā)芽率，并用直尺測量已發(fā)芽種子的根長與芽長。測量根長時，測量最長根長。每份材料每個濃度測30棵幼苗。統(tǒng)計分析不同材料在不同CdC l2濃度處理下的根長、芽長，并計算根芽比、相對根長及相對芽長，以反映其耐Cd 特性。

1.2.3 耐Cd SSSLs的篩選與QTL 鑒定以P=0.01為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)，將供試材料的性狀值進行單因素方差分析及Duncan’s多重比較，篩選出性狀值與‘華粳秈74’差異顯著的SSSLs，以這些SSSLs進行耐Cd 性QTL鑒定。在本研究中，分別對衡量耐Cd 性的相對根長與相對芽長進行QTL鑒定。對有重疊片段的SSSLs通過代換作圖[24]的方法確定QTL的最小區(qū)間。QTL 的命名參考M cCouch 等[25]的命名原則。參考Eshed 等[26]的方法計算QTL 的加性效應(yīng)及表型貢獻率：

1.2.4試驗數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)用Excel 軟件處理，方差分析用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，多重比較采用Duncan’s字母標(biāo)記法，QTL在染色體上的分布圖用Mapchart2.2軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 栽培稻品種在CdCl2溶液中發(fā)芽結(jié)果比較

圖1 部分栽培稻品種種子萌發(fā)后第7 天的根芽生長狀況Fig.1 Root and shoot growth of some cultivated rice varietieson the 7th day after germination

對‘華粳秈74’、‘新黃占’、‘中花11’、‘臺中65’、‘粵晶絲苗2號’、‘象牙香占’6個栽培稻品種的種子進行了5個CdCl2濃度的處理。分析發(fā)芽后第7天發(fā)芽率、根長、芽長、根芽比4個性狀指標(biāo)。其中在500μmol·L?1濃度下，水稻種子幾乎不發(fā)芽(圖1)。在0、30、50和100μmol·L?14個濃度下，6個栽培稻品種的種子發(fā)芽率為91%～95%，雖然在P=0.05水平，50和100μmol·L?1濃度下的發(fā)芽率與0μmol·L?1下的發(fā)芽率有顯著差異，但30、50和100μmol·L?13個濃度下發(fā)芽率沒有顯著差異(圖2)。6個栽培稻品種的根芽伸長生長明顯受到CdCl2的抑制。隨著CdCl2濃度升高，根長和芽長均顯著變短；在不同CdCl2濃度處理下，各品種種子根長較芽長更短，表明種子根的生長受到更大程度的抑制。在對照條件下，6個品種的根芽比接近1，CdC l2處理下的根芽比均小于0.5，比對照顯著變小(圖2)?？傮w來看，CdCl2脅迫處理條件下，供試水稻品種種子根、芽的伸長生長均明顯受到抑制，相同處理濃度下CdCl2對根的抑制程度大于對芽的抑制程度。

圖2 栽培稻品種在CdCl2各處理濃度下的發(fā)芽結(jié)果Fig.2 Germ ination resultsof cultivated rice varieties at different CdCl2 concentrations

圖3 栽培稻品種在不同CdCl2處理濃度下的根長與芽長Fig.3 Root and shoot length of cultivated rice varieties at different CdCl2 concentrations

此外，不同品種的根芽生長對Cd 脅迫的反應(yīng)表現(xiàn)出差異(圖3)。首先，正常發(fā)芽條件下，發(fā)芽第7天供試品種種子根長與芽長有顯著差異。‘臺中65’和‘新黃占’的根長最長，‘中花11’的根長最短；‘象牙香占’的芽長最長，‘華粳秈74’的芽長最短。其次，在C d 脅迫條件下，在不同CdCl2處理濃度下6個品種種子的根長均比對照短，且品種間差異顯著，隨著處理濃度升高，根長越

來越短(圖3A)；不同品種間及不同CdCl2處理濃度間芽長的差異較小(圖3B)。這說明根長能更好地反映栽培稻品種間耐Cd 性差異。就相對長度而言，各處理濃度下各品種的相對芽長均大于相對根長(圖4)。

圖4 栽培稻品種在不同CdCl2處理濃度下的相對根長與相對芽長Fig.4 Relative root and shoot length of cultivorted rice varietiesat different CdCl2 concentrations

以上分析結(jié)果表明，6個供試品種芽期耐Cd 性存在顯著差異，秈稻品種(‘華粳秈74’、‘新黃占’、‘粵晶絲苗2號’、‘象牙香占’)較粳稻品種(‘中花11’、‘臺中65’)更耐Cd 脅迫。就耐Cd 性的分析而言，本研究CdCl2處理濃度為50、100μmol·L?1時，相對根長和相對芽長能夠較好反映水稻品種間的耐Cd 性差異。因此，在本研究SSSLs耐Cd 處理篩選及QTL鑒定時，CdCl2處理濃度采用50和100μmol·L?1。

2.2 耐Cd SSSLs材料的篩選

對37個SSSLs材料和受體親本‘華粳秈74’做了多個批次的發(fā)芽試驗。P=0.01水平的方差分析結(jié)果表明，在CdC l2脅迫下，供試材料種子發(fā)芽第7天的根長、相對根長、芽長及相對芽長等存在顯著差異(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。以根長與芽長為性狀指標(biāo)時，在P=0.01水平，CdCl2濃度為50和100μmol·L?1時，供試SSSLs的平均根長分布范圍分別為2.48～4.93 cm 及1.77～3.03 cm，分別有14個和4個SSSLs的根長顯著長于‘華粳秈74’(圖5A)；供試SSSLs的平均芽長分布范圍分別為2.76～3.88 cm 及2.58～3.52 cm，50μmol·L?1處理濃度下有2個SSSLs 的芽長顯著長于‘華粳秈74’(圖5B)。由于本研究中各基因型材料在對照條件下發(fā)芽第7天的根長與芽長存在顯著差異，因此以各材料的相對根長與相對芽長為指標(biāo)進行耐Cd SSSLs篩選與QTL鑒定。

在P=0.01水平，以相對根長為性狀指標(biāo)時，CdCl2濃度為50μmol·L?1時篩選出7個相對根長顯著長于‘華粳秈74’的SSSLs，分別為A1、A12、A124、A14、A18、A36、A9；CdCl2濃度為100μmol·L?1時篩選出6個相對根長顯著長于‘華粳秈74’的SSSLs，分別為A 16、A 14、A 124、A 18、A 36、A 9(圖6A)。以相對芽長為性狀指標(biāo)時，CdCl2濃度為50μmol·L?1時篩選出5個相對芽長顯著長于‘華粳秈74’的SSSLs，分別為A 9、A 14、A 18、A 19、A36；CdCl2濃度為100μmol·L?1時篩選出4個相對芽長顯著長于‘華粳秈74’的SSSLs，分別為A9、A14、A18、A19(圖6B)。

2.3 SSSLs耐Cd QTLs鑒定

圖5 不同SSSLs在不同CdCl2處理濃度下根長和芽長的差異Fig.5 Differences of root and shoot length in SSSLsat different CdCl2 concentrations

圖6 不同SSSLs在不同CdCl2處理濃度下相對根長和相對芽長的差異Fig.6 Differences of relative root and shoot length in SSSLsat different CdCl2 concentrations

2.3.1 相對根長QTLs鑒定及其遺傳效應(yīng)在P=0.01水平、2個Cd 處理濃度下，A 9、A 14、A 18、A 36及A 124相對根長均顯著長于‘華粳秈74’，表明其耐Cd 性強且穩(wěn)定。根據(jù)SSSLsQTL鑒定的原理，認(rèn)為以上這些SSSLs的代換片段上攜帶有來自展穎野生稻的耐Cd QTLs(表1，圖7)。此外，根據(jù)各SSSLs代換片段的染色體分布及重疊關(guān)系，A 9、A 12、A 14及A 36的代換片段均在1號染色體上，片段重疊區(qū)間是RM 490-RM 572，因此，這4個SSSLs攜帶相同的1個相對根長QTLqRRL1-1。A18、A16、A1及A124分別在第2、3、3及6號染色體上攜帶QTLsqRRL2-1、qRRL3-1、qRRL3-2及qRRL6-1。其中qRRL1-1、qRRL2-1及qRRL6-1在2個CdCl2脅迫濃度均能鑒定到，而qRRL3-1只在100 μmol·L?1濃度出現(xiàn)，qRRL3-2只在50 μmol·L?1濃度出現(xiàn)，說明qRRL1-1、qRRL2-1及qRRL6-1是相對穩(wěn)定的QTLs。從各QTL 的加性效應(yīng)來看，在50μmol·L?1CdCl2濃度條件下，各QTL 的加性效應(yīng)分布范圍為0.19～0.60，表型貢獻率為31.18%～100.59%。qRRL1-1的平均加性效應(yīng)為0.33，表型貢獻率為55.92%，為遺傳效應(yīng)最大的QTL。在100μmol·L?1CdCl2濃度條件下，各QTL的加性效應(yīng)及表型貢獻率均小于50μmo l·L?1CdCl2，其中qRRL1-1的平均加性效應(yīng)為0.25，表型貢獻率為50.84%，依然是遺傳效應(yīng)最大的QTL。

表1 相對根長及相對芽長QTLs及其遺傳效應(yīng)1)Table 1 Identified QTLsand genetic effects for relative root and shoot length

圖7 耐Cd QTLs染色體分布Fig.7 Chromosome distribution of identified QTLs for Cd tolerance

2.3.2 相對芽長QTLs鑒定及其遺傳效應(yīng)在P=0.01水平、CdCl2濃度為50和100μmol·L?1時，分別篩選出5個(A9、A 14、A 18、A19、A36)和4個(A 9、A 14、A 18、A 19)SSSLs的相對芽長顯著長于‘華粳秈74’，本研究認(rèn)為這些SSSLs攜帶相對芽長的QTLs，具體見表1及圖7。A19在1號染色體短臂端end-PSM 024區(qū)間攜帶QTLqRSL1-1；A 36、A14及A9的代換片段在1號染色體上有重疊區(qū)間RM 490-RM 572，因此這3個SSSLs在重疊區(qū)間有1個共同的QTL，為qRSL1-2；A18在2號染色體長臂端PSM 375-end 區(qū)間攜帶QTLqRSL2-1。對各QTL 遺傳效應(yīng)分析表明，3個QTLs加性效應(yīng)均較小，分布范圍為0.08～0.18，表型貢獻率為7.43%～18.95%。其中A9攜帶的qRSL1-2在2個脅迫處理條件下均具有最大的加性效應(yīng)和表型貢獻率，這與其在相對根長中的QTL表現(xiàn)一致。

3 討論與結(jié)論

土壤Cd 污染嚴(yán)重影響水稻的正常生長，而大米又是我國居民Cd 攝入的主要途徑，約占Cd 攝入總量的56%[27]，Cd 的攝入對人體健康破壞特別大[28]，所以水稻耐Cd 研究以及培育高耐Cd 水稻品種十分關(guān)鍵。目前關(guān)于水稻種子萌發(fā)及根芽生長過程對Cd 脅迫響應(yīng)的研究報道不多，孟桂元等[3]研究表明Cd 脅迫對水稻種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)影響不顯著，對種子活力指數(shù)及根芽生長具有顯著影響；Cd 脅迫對根的抑制作用明顯大于對芽的抑制。Cd 對水稻生長的影響存在濃度效應(yīng)和時間效應(yīng)，對根系的抑制程度大于對苗的抑制程度[29]。本研究以相對根長和相對芽長為指標(biāo)分析不同基因型栽培稻品種芽期耐Cd 性，結(jié)果表明，6個供試品種的相對根長在2個CdCl2處理濃度下耐Cd 性順序相同，即：‘臺中65’＜‘中花11’＜‘新黃占’＜‘象牙香占’＜‘華粳秈74’＜‘粵晶絲苗2號’；供試品種相對芽長在2個Cd 處理濃度下耐Cd 性的變化存在差別。陳毓瑾等[30]對30個常規(guī)稻品種在發(fā)芽期進行2 mg·L?1Cd 脅迫處理，以發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、幼苗根長和幼苗芽長等指標(biāo)進行耐Cd 性研究及低Cd 積累種質(zhì)的篩選，結(jié)果表明Cd 脅迫對水稻種子的根長具有明顯的抑制效應(yīng)，對種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、幼苗芽長等指標(biāo)無顯著影響，水稻根長可以作為評價水稻種質(zhì)耐Cd 性的參考指標(biāo)，水稻品種間根長指數(shù)有顯著差異，‘IR24’是耐Cd 性最強的品種。同時，孫亞莉等[4]以50個水稻品種(系)為材料，研究了不同Cd 濃度脅迫對種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、胚芽長、胚根長、胚芽鮮質(zhì)量與胚芽干質(zhì)量等性狀的影響，表明0.5mmol·L?1Cd 脅迫濃度對各水稻品種種子的發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)影響不顯著，不同Cd 脅迫濃度對水稻種子胚根的抑制作用明顯大于胚芽，50個供試品種(系)分為Cd 脅迫敏感型、中間型和耐受型等。在水稻芽期耐Cd 性指標(biāo)分析及選擇上，本研究結(jié)果與陳毓瑾等[30]及孫亞莉等[4]的結(jié)果較為一致，說明以相對根長為指標(biāo)篩選耐Cd 種質(zhì)是可靠的。

近年來，水稻耐Cd QTL的鑒定與定位研究取得一定進展，主要是苗期耐Cd QTL 定位[15-18]及籽粒低Cd 積累含量QTL/基因的定位與克隆[6-7,14,19-21]等研究，但未見芽期耐Cd QTL 定位的報道。在水稻幼苗期耐Cd QTL 定位研究中，林輝鋒等[15]以‘Lemont’和‘Dular’雜交建立的RIL 群體，對水培條件下水稻幼苗耐Cd 脅迫的QTL 進行了初步定位，利用根長和株高作為抗性指標(biāo)分別檢測到QTLsqRAP-1a和qSAP-1b，均位于1號染色體RM 243-RM 578區(qū)間(在染色體上的物理區(qū)間：7 971 722～8 411 145 bp)，經(jīng)與本研究1號染色體定位QTLqRRL1-1及qRSL1-2的標(biāo)記區(qū)間RM 490-RM 572(6 677 153～9 866 595 bp)進行比對，發(fā)現(xiàn)RM 243-RM 578包含在標(biāo)記區(qū)間RM 490-RM 572內(nèi)，因此，本研究鑒定的相對根長QTLqRRL1-1與林輝鋒等[15]定位的qRAP-1a很可能是同一個QTL，相對芽長QTLqRSL1-2與林輝鋒等[15]定位的qSAP-1b很可能是同一個QTL。該區(qū)間與李煒星等[18]利用秈稻品種‘昌恢121’與粳稻品種‘越光’構(gòu)建的RIL 群體在幼苗期以根長作為抗性指標(biāo)所定位到的QTL的位置(1號染色體RM 8111處)非常接近，因此，認(rèn)為在1號染色體RM 490-RM 572附近應(yīng)該存在控制水稻耐Cd 性的QTL。此外，陳志德等[17]利用‘韭菜青’בIR26’構(gòu)建的RIL 群體在幼苗耐Cd 脅迫QTL 定位中，在2號染色體長臂端標(biāo)記RM 6312-RM 3860(物理區(qū)間：35 390 710～35 431 667 bp)之間定位了一個控制相對苗高的QTLqRSH-2，該區(qū)間包含在本研究鑒定的相對芽長QTLqRSL2-1的區(qū)間PSM 375-end(物理區(qū)間：33 175 495 bp～35 680 037 bp)內(nèi)，表明水稻2號染色體該區(qū)間存在與水稻地上部耐Cd 相關(guān)的QTL。綜合來看，本研究鑒定到的其余5個QTLs，即qRRL2-1、qRRL3-1、qRRL3-2、qRRL6-1及qRSL1-1，所在染色體區(qū)間與前人已定位的水稻苗期或芽期耐Cd QTL 不存在重疊區(qū)域，表明這5個QTLs可能為新的QTLs，且各QTL 來自展穎野生稻的等位基因產(chǎn)生了增效作用，增強了SSSL 的耐Cd 性。水稻不同生育期耐Cd 性及其籽粒Cd 積累特性極其復(fù)雜，目前研究者們對其遺傳及生理機制的研究尚在進行。對本文鑒定的QTLs進一步進行精細(xì)定位與克隆將有助于揭示展穎野生稻SSSLs芽期耐Cd 性的機理；此外，對攜帶芽期耐Cd QTL的SSSLs進一步開展苗期耐Cd 性以及籽粒Cd 積累的研究也有助于探索QTL 的多效性，為開展水稻耐Cd 性的分子育種奠定基礎(chǔ)。