高通量dPCR基因芯片熒光激發(fā)測控系統(tǒng)的研制

李龍成，孫劉杰，陸春生

（上海理工大學(xué) 出版印刷與藝術(shù)設(shè)計(jì)學(xué)院，上海 200093）

引 言

數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（digital polymerase chain reaction, dPCR）[1]是20世紀(jì)90年代末提出的一種新型核酸絕對定量檢測技術(shù)，dPCR技術(shù)是指將含有目標(biāo)基因、引物、聚合酶等的溶液稀釋后，分成幾十到幾十萬份微小、獨(dú)立的反應(yīng)微液滴，每個(gè)微液滴中核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。每個(gè)反應(yīng)微液滴完成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增后對結(jié)果進(jìn)行熒光檢測，將含有目標(biāo)基因的反應(yīng)器標(biāo)記為“1”（陽性），不含目標(biāo)基因的反應(yīng)器標(biāo)記為“0”（陰性），根據(jù)相對比例，并利用泊松分布就能推算出原始溶液的核酸濃度[2]。dPCR技術(shù)檢測步驟簡單、可實(shí)現(xiàn)絕對定量，且檢測過程中所需樣本少、準(zhǔn)確率高，具有高靈敏的單分子檢測能力，是現(xiàn)有PCR技術(shù)中最適于疾病早期診斷的方法[3]。dPCR芯片廣泛應(yīng)用于腫瘤的早期診斷及個(gè)體化用藥、胎兒遺傳疾病的早期篩查、轉(zhuǎn)基因食品監(jiān)測和基因文庫質(zhì)量鑒定[4-8]等方面。dPCR基因芯片測控技術(shù)正在往大功率、大視場、低成本方向發(fā)展。

熒光激發(fā)是基因檢測中示蹤物標(biāo)記常用手段，通過檢測分析示蹤物信號的分布及強(qiáng)弱得到靶分子的生物分子信息。目前市場上常見熒光激發(fā)設(shè)備中激發(fā)光源主要分為激光和LED兩大類型，雖然以激光作為激發(fā)光源的激光共聚焦掃描熒光顯微鏡具有分辨率高和信噪比高等性能，但是在實(shí)際應(yīng)用中激光會造成待檢測樣品損傷，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生無法避免的干擾。同時(shí)以激光作為激發(fā)光源的系統(tǒng)掃描方式多為二維點(diǎn)掃描，大大限制了檢測時(shí)間的縮短。以窄帶LED為激發(fā)光源的熒光激發(fā)系統(tǒng)短時(shí)間內(nèi)能夠在視場中一次成像。同時(shí)以窄帶LED為激發(fā)光源的設(shè)備與激光設(shè)備相比具有結(jié)構(gòu)簡單、成本低等顯著優(yōu)點(diǎn)，LED自身的冷光源屬性不會對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)熱環(huán)境及檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，在閱讀大量國內(nèi)外文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，經(jīng)過對比分析后，最終選擇以大功率、窄帶LED作為熒光激發(fā)光源展開系統(tǒng)的研發(fā)設(shè)計(jì)工作。

目前，國內(nèi)外研究人員對以LED作為熒光激發(fā)光源的設(shè)備開展了許多研究。早在2011年10月，Biorad公司研發(fā)出公司第一代性能優(yōu)異的QX100 PCR系統(tǒng)；2012年美國RainDance Technologies公司推出了RainDropTM數(shù)字PCR系統(tǒng)；2013年8月，Bio-rad公司研發(fā)出性能優(yōu)異的QX100和QX200數(shù)字PCR系統(tǒng)；2016年日本的Yong等用無濾光熒光傳感器檢測亞微米濃度熒光染料溶液中的熒光。該無濾光熒光傳感器具有光柵結(jié)構(gòu)，可根據(jù)不同柵電壓下的光電流計(jì)算激發(fā)強(qiáng)度和熒光燈強(qiáng)度。研制的無濾光熒光傳感器對LED光源的激發(fā)光（470 nm）和熒光（530 nm）的分離能力為 1 200∶1[9]。

針對dPCR儀光電系統(tǒng)中以LED作為熒光激發(fā)光源的應(yīng)用，國內(nèi)高校范圍內(nèi)的研究人員也做出了多方面的探索。2012年北京工業(yè)大學(xué)李倩對生物芯片熒光檢測中微體積高強(qiáng)度多LED集成技術(shù)與工藝進(jìn)行了研究[10]。浙江大學(xué)對于LED在熒光激發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用開展了深入研究：2011年王偉平等已經(jīng)開始對96孔實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測系統(tǒng)的開發(fā)進(jìn)行研究，對LineGene9600實(shí)時(shí)熒光PCR檢測系統(tǒng)的性能進(jìn)行優(yōu)化、提升[11]；2011年徐靈艷開發(fā)了一套小型微流控芯片-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)濁度檢測系統(tǒng)，通過該系統(tǒng)中對鎢燈和白熾燈為代表的復(fù)色光源與激光、激光二極管（LD）、發(fā)光二極管（LED）進(jìn)行對比研究分析[12]；2015年，毛賀在《定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)熒光檢測技術(shù)研究》中對光源激發(fā)主波長為470 nm的藍(lán)光LED的熒光激發(fā)效果進(jìn)行探索[13]；2016年，袁茂凱等以LED作為熒光激發(fā)光源設(shè)計(jì)了一套穩(wěn)定性高的專用LED驅(qū)動電路及其配套檢測系統(tǒng)[3]。

為了解決dPCR基因芯片熒光激發(fā)及檢測過程中激光激發(fā)光源成本高、熒光顯微鏡檢測視場小、現(xiàn)有LED作為激發(fā)光源功率低等問題，本研究以上海市科學(xué)技術(shù)委員會地方院校能力建設(shè)項(xiàng)目為依托，設(shè)計(jì)了一套基于STM32微處理器進(jìn)行控制的系統(tǒng)。系統(tǒng)以大功率、窄帶LED作為激發(fā)光源，通過FAM、HEX和ROX三個(gè)熒光激發(fā)通道，可以一次性單通道完成較大視場內(nèi)的基因芯片激發(fā)。該熒光激發(fā)系統(tǒng)具有多個(gè)獨(dú)立激發(fā)通道、單通道LED激發(fā)功率大、激發(fā)功率可調(diào)節(jié)、系統(tǒng)熱穩(wěn)定性好、檢測結(jié)果精準(zhǔn)等顯著優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果說明該系統(tǒng)能夠多通道、快速實(shí)現(xiàn)dPCR基因芯片的熒光激發(fā)。

1 系統(tǒng)設(shè)計(jì)

1.1 測控系統(tǒng)架構(gòu)設(shè)計(jì)

整個(gè)熒光激發(fā)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)主要包含熒光激發(fā)光源系統(tǒng)、控制電路系統(tǒng)和通信系統(tǒng)三大模塊，整個(gè)測控系統(tǒng)各個(gè)功能模塊之間架構(gòu)如圖1所示。

圖1 整個(gè)系統(tǒng)的架構(gòu)設(shè)計(jì)Fig. 1 The architecture design of the whole system

1.2 熒光激發(fā)原理及光源系統(tǒng)設(shè)計(jì)

熒光激發(fā)過程中，當(dāng)待檢測分子的電子在吸收了特定波長的能量后，待檢測分子的電子將從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。處于激發(fā)態(tài)的分子為了從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，該分子會馬上釋放出能量，處于激發(fā)態(tài)的分子回到基態(tài)可以通過如圖2所示幾種途徑。

圖2 分子內(nèi)激發(fā)與衰變過程Fig. 2 Intramolecular excitation and decay process

由于檢測分子在S2的狀態(tài)是極不穩(wěn)定的，檢測分子的電子會在10-9～10-7s的時(shí)間內(nèi)重新回到基態(tài)，電子由第一激發(fā)躍遷到任意一個(gè)振動能級而發(fā)射的光量子稱為熒光[14]，通過配套的光電系統(tǒng)能夠精準(zhǔn)地檢測到待檢測分子中熒光標(biāo)記物的分布和熒光強(qiáng)度。

如果固定測量熒光的某個(gè)發(fā)射波長，而不斷改變激發(fā)光的波長，得到的熒光強(qiáng)度對激發(fā)波長的譜圖即為熒光激發(fā)譜，熒光激發(fā)譜表明了熒光強(qiáng)度對激發(fā)波長的依賴關(guān)系[15]。熒光激發(fā)過程中結(jié)合誘導(dǎo)熒光技術(shù)，在激發(fā)光（通常為紫外線或低波長可見光）的照射下，吸收能量后的熒光分子變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)熒光分子為了回到基態(tài)將以輻射光量子的形式釋放出能量并產(chǎn)生熒光信號[16]。

激發(fā)光源作為熒光激發(fā)系統(tǒng)的關(guān)鍵部分，目前市場上常見的dPCR系統(tǒng)設(shè)備中，主流的熒光激發(fā)光源分為激光和LED兩大類型。作為可選光源的高壓汞燈、高壓氙燈、金屬鹵化物燈等傳統(tǒng)的紫外激發(fā)源，以及高相干激光激發(fā)源，都具有體積大、成本高、壽命短的缺點(diǎn)[17]。因此，以激光作為激發(fā)光源的熒光激發(fā)系統(tǒng)一直未得到廣泛應(yīng)用，在國內(nèi)完全依賴于國外進(jìn)口。本系統(tǒng)以大功率、窄帶LED作為激發(fā)光源，冷光源LED不會對PCR反應(yīng)熱環(huán)境產(chǎn)生干擾，而且窄帶LED無需過濾便可直接發(fā)出單色光[13]。

整個(gè)系統(tǒng)設(shè)計(jì)時(shí)選取FAM、HEX和ROX三種常見熒光素作為dPCR反應(yīng)過程中的熒光染料，根據(jù)FAM、HEX和ROX的激發(fā)光譜波長分布，分別選擇主峰波長為465～480 nm的藍(lán)光LED、主峰波長為520～535 nm的綠光LED、主峰波長為580～600 nm的黃光LED分別作為FAM、HEX和ROX通道的熒光激發(fā)光源。

根據(jù)圖3中FAM、HEX和ROX激發(fā)通道對應(yīng)熒光素的激發(fā)波譜及其所屬LED光源的波譜分布，光源工作系統(tǒng)設(shè)計(jì)如圖4所示。系統(tǒng)通過對FAM、HEX和ROX通道激發(fā)光源工作時(shí)間、激發(fā)光源功率等的調(diào)節(jié)可實(shí)現(xiàn)基因芯片反應(yīng)產(chǎn)物的熒光激發(fā)。激發(fā)光源系統(tǒng)中FAM、HEX和ROX相鄰兩個(gè)通道的激發(fā)光源之間夾角為120°，通過相位開關(guān)控制激發(fā)光源各個(gè)通道交替工作，激發(fā)光源完成平臺基因芯片各通道的熒光激發(fā)。

圖3 各通道激發(fā)光源對應(yīng)波譜分布Fig. 3 Spectral distribution of excitation light sources corresponding to each channel

1.3 系統(tǒng)的設(shè)計(jì)目標(biāo)

為了解決dPCR以LED作為熒光激發(fā)光源的系統(tǒng)中功率小、系統(tǒng)自動化程度低、熒光檢測光學(xué)設(shè)備復(fù)雜等問題，在研究過程中以半波寬（FWHM）小于10 nm的窄帶LED作為系統(tǒng)激發(fā)光源。系統(tǒng)通過DC-DC轉(zhuǎn)換電路設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)整個(gè)工作電源的供給，電路的設(shè)計(jì)最大電流達(dá)8 A，各自獨(dú)立通道的熒光激發(fā)光源功率可進(jìn)行獨(dú)立調(diào)節(jié)。其中FAM激發(fā)光源電路工作電流為350 mA，整個(gè)電路可調(diào)節(jié)最大功率為3 W；HEX激發(fā)光源電路工作電流為350 mA，整個(gè)電路可調(diào)節(jié)最大功率為 3W；ROX激發(fā)光源電路工作電流為350 mA，整個(gè)電路可調(diào)節(jié)最大功率為2 W，整個(gè)系統(tǒng)激發(fā)光源的調(diào)節(jié)精確度＜1.0%。

圖4 光源系統(tǒng)結(jié)構(gòu)Fig. 4 Structure of light source system

2 系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)

2.1 控制電路模塊

整個(gè)測控系統(tǒng)以STM32F103RET6作為處理器，處理器通過PWM脈沖實(shí)現(xiàn)對應(yīng)通道激發(fā)光源LED的調(diào)節(jié)。整個(gè)STM32外圍電路主要由電壓轉(zhuǎn)換模塊、激發(fā)光源控制模塊、LED恒流驅(qū)動控制電路模塊等組成。

為了使系統(tǒng)能夠獲得較大功率的恒流穩(wěn)定電源，系統(tǒng)通過XL4016開關(guān)降壓型DC-DC轉(zhuǎn)換芯片實(shí)現(xiàn)整個(gè)工作電源的供給。系統(tǒng)轉(zhuǎn)換電路的設(shè)計(jì)最大電流達(dá)8 A，為提升系統(tǒng)可靠性并對CCD光電系統(tǒng)設(shè)備起到保護(hù)作用，電路系統(tǒng)以TL431可控精密穩(wěn)壓源為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了一套保護(hù)電路：當(dāng)場效應(yīng)晶體管（MOSFET-P）負(fù)載電壓大于12.5 V時(shí)晶體管自動斷開，避免因電壓過大造成檢測設(shè)備損壞。系統(tǒng)通過微處理器產(chǎn)生的PWM脈沖作用于大功率恒流驅(qū)動控制芯片（QX9920）實(shí)現(xiàn)整個(gè)激發(fā)光源系統(tǒng)的調(diào)節(jié)控制，部分控制系統(tǒng)的電路結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)如圖5所示。

式中：TD為芯片固定關(guān)斷延遲時(shí)間，值為61 ns。

LED的輸出電流ILED由電流采樣電阻RCS以及TOFF等參數(shù)設(shè)定，為

圖5 系統(tǒng) PWM 調(diào)光電路結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)Fig. 5 PWM dimming circuit design of the system

式中：VLED為LED的正向?qū)▔航?；L1為電感值。在電路設(shè)計(jì)中為保證系統(tǒng)輸出恒流，在功率電感的選擇時(shí)必須保證流過LED的紋波電流值遠(yuǎn)小于流過LED通道的電流峰值，即：

式中：VIN為芯片輸入電壓。

2.2 通信模塊

如圖6，整個(gè)測控系統(tǒng)的通信設(shè)計(jì)以PC為上位機(jī)，PC對接收到的傳輸數(shù)據(jù)進(jìn)行快速分析、處理。系統(tǒng)通過微處理器連接的USB接口實(shí)現(xiàn)整個(gè)系統(tǒng)與上位機(jī)之間的通信。STM32F103-RET6自帶512 kB FLASH，在上位機(jī)與下位機(jī)通信時(shí)間間隔內(nèi)上位機(jī)PC端完成接收數(shù)據(jù)的處理。串口通信過程中通過上位機(jī)與下位機(jī)之間數(shù)據(jù)交互時(shí)間間隔、校驗(yàn)位和波特率等的設(shè)置來提升數(shù)據(jù)傳輸?shù)姆€(wěn)定性和可靠性。

3 系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過STM32F103RET6微處理器實(shí)現(xiàn)整個(gè)測控系統(tǒng)的控制，系統(tǒng)中QX9920PWM信號來源于微處理器定時(shí)器的三個(gè)通道，通過式（1）中電容值的選取，設(shè)定光源的關(guān)斷時(shí)間。整個(gè)測控系統(tǒng)以STM32微處理器PA1、PA2、PA3 I/O端口分別作為FAM、HEX、ROX三個(gè)通道激發(fā)光源的控制信號來源。

經(jīng)過試驗(yàn)測試，當(dāng)系統(tǒng)PWM調(diào)光頻率設(shè)定為250 Hz時(shí)，通過對TIM3_CH1～TIM3_CH3通道PWM占空比設(shè)置實(shí)現(xiàn)0～255共256個(gè)等級的調(diào)節(jié)控制。圖7為STM32調(diào)制出占空比分別80%、70%和60%時(shí)的光源驅(qū)動電路邏輯分析圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明系統(tǒng)調(diào)節(jié)精確度達(dá)0.4%。

圖8為使用S1500-M-R（G）-CL CMOS相機(jī)進(jìn)行的基因芯片熒光檢測結(jié)果，系統(tǒng)在FAM、HEX、ROX三個(gè)通道下調(diào)整相機(jī)的曝光時(shí)間，完成對樣品中三種熒光素對應(yīng)熒光通道的拍攝。

根據(jù)FAM、HEX和ROX熒光通道的檢測結(jié)果，S1500-M-R（G）-CL CMOS相機(jī)一次曝光可完成HEX通道視野中面積約為11.82 mm×7.88 mm的近3 800個(gè)微液滴熒光激發(fā)結(jié)果的檢測。FAM通道激發(fā)源一次可完成9 600個(gè)微液滴的熒光激發(fā)。圖9（a）中白色亮點(diǎn)處均為dPCR基因芯片HEX通道熒光激發(fā)結(jié)果成陽性的微液滴。圖（a）中黃色線所在區(qū)域樣品點(diǎn)對應(yīng)灰度值分布直方圖如圖（b）所示，通過灰度分布直方圖中峰值對比分析能準(zhǔn)確辨別各熒光激發(fā)結(jié)果為陽性的微液滴位置分布?；叶戎捣植紙D的生成和應(yīng)用能夠?yàn)楹笃诘墓怆娤到y(tǒng)檢測、目的基因識別提供精準(zhǔn)的樣本信息。

圖6 系統(tǒng)通信組織架構(gòu)Fig. 6 System communication structure

圖7 光源驅(qū)動電路邏輯分析圖Fig. 7 Logic analysis diagram of light source driving circuit

圖8 各通道熒光檢測結(jié)果成像Fig. 8 Imaging of fluorescence detection results of each channel

圖9 熒光激發(fā)效果檢測Fig. 9 Detection of fluorescence excitation

4 結(jié) 論

本文基于STM32微處理器設(shè)計(jì)了一套高通量dPCR基因芯片熒光激發(fā)測控系統(tǒng)，該系統(tǒng)選取窄帶LED作為激發(fā)光源，F(xiàn)AM、HEX和ROX互相獨(dú)立的熒光激發(fā)通道設(shè)計(jì)簡化了PCR反應(yīng)產(chǎn)物熒光激發(fā)結(jié)果的繁瑣分析過程。系統(tǒng)激發(fā)光源部分最大輸出電流可達(dá)8 A，調(diào)節(jié)精確度達(dá)0.4%，最大輸出功率3 W。測試實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明系統(tǒng)一次可實(shí)現(xiàn)dPCR基因芯片9 600個(gè)微液滴的熒光激發(fā)，滿足dPCR基因芯片的高通量和熒光激發(fā)的設(shè)計(jì)需求。該系統(tǒng)具有多個(gè)獨(dú)立激發(fā)通道、單通道LED激發(fā)功率大、激發(fā)功率可調(diào)節(jié)、系統(tǒng)熱穩(wěn)定性好、檢測結(jié)果精準(zhǔn)等顯著優(yōu)點(diǎn)，該系統(tǒng)的成功實(shí)現(xiàn)可為dPCR基因芯片領(lǐng)域工作人員節(jié)省大量時(shí)間成本和人力成本。

此外，本設(shè)計(jì)系統(tǒng)中，基于STM32微處理器的系統(tǒng)功能仍有許多可以拓展的地方。如利用STM32的強(qiáng)大功能提升整個(gè)熒光激發(fā)系統(tǒng)智能化程度，同時(shí)系統(tǒng)可以采用無線通信的方式，以此為基礎(chǔ)開發(fā)出便攜式的基因芯片使用設(shè)備，進(jìn)而擴(kuò)寬dPCR基因芯片技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域。