卵泡液中抗精子抗體的檢測及對受精能力的評估

馬文葉，金 銳，康卉嫻，代 良，唐大偉，白 剛，劉 芳，任萌萌，包俊華

不孕不育癥患者中有10%～30%為抗精子抗體(AsAb)等免疫因素導致的不孕[1-2]。女性體內(nèi)的AsAb是機體對精子抗原產(chǎn)生的同種異體免疫反應的產(chǎn)物，普遍存在于不育癥患者的卵泡液、血清及精液中，可阻礙精子與透明帶以及卵膜接觸，降低受精率。在體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射(IVF/ICSI-ET)的治療過程中，有10%～20%的周期會發(fā)生受精完全失敗[3]，及早發(fā)現(xiàn)患者的受精能力是實施早期補救ICSI的關鍵。通過檢測卵泡液中AsAb的陽性率，及早預警患者受精失敗的可能性，以幫助胚胎培養(yǎng)室人員適時實施RICSI。

1 資料與方法

1.1 一般資料：回顧性分析我院2017年9月-2018年5月因輸卵管因素助孕的患者194例，符合納入標準患者141例。按不孕原因分為：原發(fā)不孕組70例，繼發(fā)不孕組71例。按受精方式分為：A組，即常規(guī)IVF組，共89例；B組，即前次受精失敗改行ICSI組，共32例；C組，即IVF短時受精完全失敗行RICSI組，共20例。納入標準：①年齡≤35歲；②首次接受IVF -ET助孕治療；③因IVF受精失敗首次改為ICSI再次助孕治療者；④獲卵數(shù)目在10～15個。排除標準：①取卵當日因精液問題臨時改為ICSI；②采用供精實施IVF-ET的患者。

1.2 促排卵方案及受精觀察：均采用高孕激素狀態(tài)下促排卵方案(PPOS)或卵泡期長方案，當目標卵泡有2個≥20 mm時，且≥16 mm占≥14 mm的卵泡數(shù)目比大于60%時，注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)5 000～10 000后36～38 h，在B超引導下經(jīng)陰道取卵。hCG注射后39～40 h按精子/卵母細胞的比例加入經(jīng)處理優(yōu)化后的精子，受精4～6 h后拆去卵母細胞周圍的顆粒細胞，于倒置顯微鏡下觀察極體及卵母細胞胞漿情況。明確第二極體出現(xiàn)率小于50%，對所有明確單極體成熟的MII卵子實施RICSI。

1.3 研究方法：取卵當日留取無血污染的卵泡液，離心取上清液2 mL于-20 ℃冰箱中保存待測。AsAb抗體檢測試劑盒由濰坊市康華生物技術有限公司提供，采用ELISA法。實驗操作、結果陰性和陽性判斷均嚴格按照試劑說明書。

2 結果

2.1 原發(fā)與繼發(fā)不孕患者一般資料比較:原發(fā)與繼發(fā)不孕患者不孕年限、Gn總量、Gn天數(shù)、獲卵數(shù)、成熟率、受精率、正常受精率和卵裂率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。

表1 原發(fā)不孕與繼發(fā)不孕患者臨床一般資料的比較

2.2 3組患者一般情況比較：A組、B組、C組的年齡、不孕年限、Gn總量、Gn天數(shù)、獲卵數(shù)和卵裂率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。

表2 3組患者一般情況的比較

2.3 原發(fā)與繼發(fā)不孕組早期補救率、卵泡液AsAb陽性率比較:原發(fā)不孕組早期補救率為21.43%，繼發(fā)不孕組為7.04%；原發(fā)不孕組AsAb陽性率為28.57%，繼發(fā)不孕組為9.86%，2組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，原發(fā)不孕組患者的早期補救率和卵泡液AsAb陽性率顯著高于繼發(fā)不孕組，見表3。

表3 2組不孕患者卵泡液AsAb陽性率的比較[n(%)]

2.4 3組患者正常受精率、AsAb陽性率比較：A組、B組、C組的正常受精率(52.53%，69.23%與68.57%，P<0.05)和AsAb陽性率(15.73%，34.38%與10.00%，P<0.05)差異有統(tǒng)計學意義，其中B組和C組的正常受精率顯著高于A組，且B組的AsAb陽性率最高，見表4。

表4 3組患者正常受精率、AsAb陽性率的比較[n(%)]

3 討論

IVF-ET技術在近30年來的廣泛應用幫助眾多不孕夫婦完成做父母的夢想，但是仍有30%左右的患者在實施常規(guī)體外受精時出現(xiàn)受精失敗，導致患者沒有可利用的胚胎，無法移植，給本人和家庭造成經(jīng)濟和心理的雙重打擊。而早期補救ICSI 技術[4-5]的出現(xiàn)很好地彌補了部分常規(guī)體外受精發(fā)生受精失敗的不良結局，減少了因無可移植胚胎對患者造成的不利影響。

但是，目前胚胎實驗室主要以分析觀察受精后排出第二極體卵母細胞的比例來決定是否對患者實施補救ICSI,條件較為單一。由于卵母細胞成熟發(fā)育不同步，在受精6 h后仍有8%左右的卵子推遲了第二極體的排出時間；另外當?shù)谝粯O體出現(xiàn)碎片或分裂時很難與第二極體進行區(qū)分[6],往往造成對卵母細胞受精情況的誤判，失去或者延誤了實施早期補救ICSI的最佳時機，仍然會造成一部分患者沒有可利用胚胎的不良結局。所以，探尋更多的評估患者受精能力的指標就成為目前胚胎培養(yǎng)工作人員研究的難點。

常規(guī)體外受精失敗的原因可能有：精卵成熟不良，精子與卵子透明帶結合障礙，配子融合障礙等[7-9]。AsAb廣泛存在于人體的血液和體液中，卵泡液中也可以檢測到AsAb。AsAb主要通過以下機制影響精子與卵子結合：①抑制精子頂體酶的活性，從而抑制頂體反應的發(fā)生；②抑制精子對透明帶的附著與穿透，使精子不能穿過透明帶。本研究結果顯示，原發(fā)不孕組的早期補救率和AsAb陽性率與繼發(fā)不孕組比較有顯著性差異，2組的AsAb陽性率均符合資料報道的10%～30%不孕患者中可檢測出AsAb。AsAb陽性率在原發(fā)不孕癥患者中具有較高比例，說明AsAb可能是原發(fā)不孕患者導致受精失敗的原因之一。

本研究通過對不同受精方式的A組、B組和C組患者卵泡液中AsAb的檢測，評估AsAb對受精能力的影響，結果顯示A組、B組、C組的正常受精率和AsAb陽性率有顯著性差異。其中B組和C組的正常受精率顯著高于A組，且B組的AsAb陽性率最高，原因是這組患者前一周期受精失敗行RICSI，這一周期直接做ICSI。結果表明，卵泡液中的AsAb陽性率對原發(fā)不孕患者早期補救ICSI的操作具有一定的預測價值。

我院于IVF加精后4～6 h拆除卵周顆粒細胞，觀察第二極體排出情況及卵胞漿形態(tài)學的改變，未觀察到明確第二極體或明確第二極體比率低于50%，對所有明確單極體且胞漿無形態(tài)學改變的卵子及時行RICSI。而對存在碎片樣極體的卵子是否應及時行RICSI決定較慎重，根據(jù)極體的碎片分布及間隔1～2 h后再次觀察碎片的大小、形態(tài)、位置是否改變，并結合胞漿的皮質反應情況及原核出現(xiàn)情況，綜合判斷卵母細胞是否受精。因此有必要進一步通過定性檢測體外受精患者取卵后卵泡液中AsAb陽性情況，聯(lián)合對胚胎形態(tài)學的觀察，幫助胚胎培養(yǎng)室人員盡早發(fā)現(xiàn)受精失敗患者，對受精異常者有更及時、更準確的評估。本研究的患者樣本量較少，仍需要擴大樣本量進一步研究，為選擇一個相對更安全、更有效的受精方式，降低受精失敗、取消周期的風險，提高治療的成功率提供更多的臨床研究數(shù)據(jù)。