高危型HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)宮頸病變分層管理的臨床意義

帥汝臻,韓淑霞,李丹丹,吳 學(xué),蘇紅霞,潘 婷,劉 丹,4

幾十年來(lái)，在對(duì)癌癥的病毒病因?qū)W探索中，高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)與宮頸癌的致病相關(guān)性以及相應(yīng)的疫苗研究仍是最偉大的研究成果[1]。我國(guó)宮頸癌是15～44歲的女性中第二大癌癥死亡原因。目前我國(guó)的初篩策略仍推薦宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)聯(lián)合高危型人乳頭瘤病毒檢測(cè)的方式。但宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢測(cè)敏感性低以及參差不齊的病理閱片技術(shù)，使檢測(cè)精確度波動(dòng)在31%～78%，出現(xiàn)了較高的假陰性率和大量意義不明的非典型鱗狀細(xì)胞(ASC-US)現(xiàn)象[2-5]。由此通過(guò)比較HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA兩種檢測(cè)方法在不同級(jí)別宮頸病變中的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估效能及HPV E6/E7 mRNA的表達(dá)水平[6-7]，評(píng)估HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)方法對(duì)不同級(jí)別宮頸病變分層管理的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料：2016年1月-12月就診于寧夏醫(yī)科大學(xué)宮頸病變中心，細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果≥ASC-US受檢者148例，年齡23～73歲，平均(42.64±10.30)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①明確知情同意，自愿加入本研究，具有隨訪(fǎng)條件者；②具有完整HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA、陰道鏡下宮頸病理活檢或錐切病理檢查結(jié)果者；③無(wú)免疫缺陷及腫瘤治療者；④未孕者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①72 h 內(nèi)有陰道灌洗及用藥者；②接受抗HPV藥物治療者；③子宮切除患者；④無(wú)隨訪(fǎng)條件及資料不全者。研究?jī)?nèi)容征得所有入選患者的知情同意及倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本采集：受檢者取截石位，窺器暴露宮頸輕拭去宮頸外口分泌物，專(zhuān)用毛刷于宮頸外口鱗柱狀交界部順時(shí)針旋轉(zhuǎn)5～10圈收集脫落細(xì)胞，分別將刷頭置于內(nèi)含HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA保存液的試管中。

1.2.2 宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果：按照2001年國(guó)際癌癥協(xié)會(huì)推薦的TBS分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[8]統(tǒng)一分類(lèi)。Thin Prep 2000(美國(guó)Thin Prep Cytyc公司),液基細(xì)胞學(xué)(TCT)保存液(美國(guó)Cytyc公司)。

1.2.3 HPV DNA雜交捕獲法(HC2)檢測(cè)：HPV DNA 檢測(cè)儀 DML 2000(美國(guó)Digene 公司),HC2 HPV DNA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Digene公司)。

1.2.4 宮頸穩(wěn)態(tài)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)HPV E6/E7 mRNA：HPV E6/E7 mRNA冷光儀(科蒂亞生物技術(shù)有限公司),HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)試劑盒(科蒂亞生物技術(shù)有限公司)。

1.2.5 病理組織學(xué)活檢：對(duì)細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果≥ASC-US的患者行陰道鏡檢查，提示異常后于可疑病變部位及宮頸3、6、9、12點(diǎn)行病理學(xué)活檢；宮頸錐切標(biāo)本活檢。

2 結(jié)果

2.1 以宮頸組織病理學(xué)診斷為結(jié)果的≥ASC-US患者的年齡比較：不同組織病理類(lèi)型中年齡比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.193，P<0.05)，進(jìn)一步兩兩比較顯示宮頸浸潤(rùn)癌組年齡高于其他各組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同組織病理類(lèi)型組間年齡比較

2.2 不同組織學(xué)類(lèi)型的宮頸病變HPV DNA與HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性檢出率比較：CIN Ⅰ和CIN Ⅱ中HPV DNA的陽(yáng)性檢出率高于HPV E6/E7 mRNA(P<0.05)，其他組織學(xué)類(lèi)型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對(duì)各組中HPV DNA陽(yáng)性例數(shù)分別比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組中HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性例數(shù)的比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.613，P<0.05)。趨勢(shì)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示HPV DNA與HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)隨著組織學(xué)類(lèi)型的升級(jí)陽(yáng)性檢出率升高(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同組織病理學(xué)類(lèi)型與HPV DNA及HPV E6/E7 mRNA檢出率比較[n(%)]

2.3 細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果中各組HPV DNA與HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性檢出率的一致性比較：在不明意義的非典型鱗狀細(xì)胞(ASC-US)、能排除高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變不典型鱗狀細(xì)胞(ASC-H)、低度鱗狀上皮內(nèi)瘤變(LSIL)組別中，HPV DNA與HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性檢出率具有較好的一致性，各組Kappa值相比，兩種陽(yáng)性檢出率在ASC-H中一致性最好，見(jiàn)表3。

2.4 宮頸組織病理學(xué)檢測(cè)中各組HPV DNA與HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性檢出率的一致性：在炎癥伴挖空細(xì)胞、CIN Ⅰ、CIN Ⅱ及宮頸浸潤(rùn)癌組別中HPV DNA與HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性檢出率具有較好的一致性，見(jiàn)表4。

表3 TCT檢測(cè)不同細(xì)胞病理類(lèi)型HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性檢出率一致性檢驗(yàn)[n(%)]

2.5 CIN Ⅱ及以上組織病理類(lèi)型中HPV DNA與HPV E6/E7 mRNA的篩檢效能：在CIN Ⅱ及以上組織學(xué)類(lèi)型中HPV DNA與HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的靈敏度均為86.7%，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)特異度高于HPV DNA檢測(cè)特異度，二者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HPV DNA與HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值分別為67.8%、63.6%、75.0%、72.7%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表5。

表4 不同組織學(xué)類(lèi)型HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA一致性檢驗(yàn)[n(%)]

表5 CIN Ⅱ及以上組織學(xué)類(lèi)型中HPV DNA與HPV E6/E7 mRNA的篩檢效能[n(%)]

2.6 高級(jí)別宮頸病變(≥CIN Ⅱ)中HPV DNA與HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的準(zhǔn)確性：HPV DNA與HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)ROC曲線(xiàn)下面積分別為0.795、0.742，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)準(zhǔn)確性?xún)?yōu)于HPV DNA檢測(cè),見(jiàn)圖1(目錄后)。

2.7 不同組織病理類(lèi)型中HPV E6/E7 mRNA表達(dá)量(copy值)比較：不同組織學(xué)類(lèi)型中HPV E6/E7 mRNA的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=53.877，P<0.05)，進(jìn)一步兩兩比較顯示浸潤(rùn)癌的表達(dá)量最高，其次為CIN Ⅲ，而慢性宮頸炎的表達(dá)量最低，其他三種組織學(xué)類(lèi)型的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表6。

表6 不同組織學(xué)類(lèi)型中HPV E6/E7 mRNA表達(dá)量(copy值)比較[n(%)]

3 討論

3.1 HPV檢測(cè)是宮頸病變篩查管理體系的重要部分：超過(guò)75%的性活躍女性在其有生之年會(huì)感染人乳頭瘤病毒，但多為一過(guò)性的或在相對(duì)較短的時(shí)間(6～12個(gè)月)內(nèi)被自體免疫系統(tǒng)清除[9-11]。宮頸癌從癌前病變逐步進(jìn)展為浸潤(rùn)癌是高危型HPV持續(xù)感染的病理過(guò)程，這一過(guò)程要8～15年[12]。其間多因素的共同作用會(huì)使患者出現(xiàn)巨大的預(yù)后差別，因此，對(duì)于高級(jí)別宮頸病變的轉(zhuǎn)歸以高危型HPV為基礎(chǔ)的篩查及動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)體系意義重大。由于HPV感染在全球呈現(xiàn)明顯的地理因素差異，因此目前尚無(wú)一個(gè)全球統(tǒng)一的篩查體系，不同國(guó)家需要根據(jù)人口基礎(chǔ)和衛(wèi)生資源制定適宜性篩查及管理體系，我國(guó)部分地區(qū)仍然僅靠宮頸刮片等單一細(xì)胞學(xué)技術(shù)進(jìn)行宮頸病變的篩查和管理。對(duì)于一個(gè)人口眾多、病理閱片水平良莠不齊的發(fā)展中國(guó)家而言，采用TCT聯(lián)合HPV檢測(cè)可能更適合作為初篩策略[13]，同時(shí)為需要密切隨訪(fǎng)的不明意義非典型鱗狀細(xì)胞(ASC-US)受檢者及細(xì)胞學(xué)結(jié)果正常的宮頸病變高危人群進(jìn)行分層管理提供了更好的依據(jù)。2018年一匯總了中國(guó)104項(xiàng)研究的28 923例ASC-US患者的HPV檢測(cè)中，總陽(yáng)性率為52.09%，盡管不同等級(jí)醫(yī)院HPV檢測(cè)的陽(yáng)性率變異范圍存在差異，仍然可認(rèn)為HPV檢測(cè)是ASC-US患者分流的有效方法[14]。

3.2 HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)更有利于評(píng)估HPV感染對(duì)宮頸上皮細(xì)胞的影響：雖然HPV DNA檢測(cè)的敏感性較好，但對(duì)所有感染者行陰道鏡檢查會(huì)引起不必要的恐慌和衛(wèi)生資源浪費(fèi)，我們?cè)趯?duì)HPV的研究中試圖尋找到更精確的可以反映病毒量及活性、評(píng)估病變發(fā)生發(fā)展的指標(biāo)。近年研究發(fā)現(xiàn)，高危型HPV在宿主中的病毒活性、致癌機(jī)制與E6、E7病毒癌基因表達(dá)失控大量轉(zhuǎn)錄E6/E7 mRNA 有密切相關(guān)性，E6通過(guò)募集E6AP誘導(dǎo)抑癌蛋白P53泛素化連接和降解P53來(lái)降低P53的水平，E7蛋白具有連接抑癌蛋白pRb的能力，其中pRb/E2F復(fù)合體的失活可導(dǎo)致包括Ki-67在內(nèi)的負(fù)責(zé)細(xì)胞增殖的核蛋白的E2F目標(biāo)基因過(guò)表達(dá)[15]。除此以外，還可以幫助HPV病毒以多種方式攻擊主要的細(xì)胞通路，為自己創(chuàng)造“后備計(jì)劃”，以確保細(xì)胞通路不受調(diào)控。其結(jié)果是持續(xù)感染，宿主細(xì)胞的繁殖和病毒的復(fù)制感染鄰近細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。HPV E6/E7 mRNA的持續(xù)表達(dá)成為宮頸癌形成的必經(jīng)步驟[16]。目前歐洲國(guó)家如挪威和芬蘭，普遍推薦宮頸檢查和HPV E6/E7 mRNA測(cè)試的后續(xù)檢查，認(rèn)為HPV E6/E7基因檢測(cè)比HPV DNA檢測(cè)對(duì)癌癥的診斷有更大的特異性[17]。我們認(rèn)為這個(gè)指標(biāo)可能把處于致病程序中的HPV與一過(guò)性感染處于靜止?fàn)顟B(tài)的HPV區(qū)別開(kāi)來(lái)。在我們的研究中，ASC-US以上的患者HPV陽(yáng)性檢出率高于HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性檢出率，這也說(shuō)明HPV感染中僅有部分具有病毒癌基因活性的患者可能最終走上宮頸病變的演化過(guò)程。我們的研究也表明隨著病理級(jí)別的不斷升級(jí)，HPV E6/E7 mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，這可反映宮頸病變的嚴(yán)重程度[18]。

3.3 HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)ASC-US以上宮頸病變者進(jìn)行分層評(píng)估管理及轉(zhuǎn)歸預(yù)測(cè)：在細(xì)胞閱片體系尚不完善的現(xiàn)實(shí)中產(chǎn)生的大量ASC-US給患者和臨床工作者帶來(lái)困擾，用更加精確的評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)指標(biāo)對(duì)其進(jìn)行分層管理是我國(guó)目前宮頸癌篩查體系的重要目標(biāo)[19]。本研究結(jié)果證實(shí)在宮頸病變篩查中HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)具有與HPV DNA檢測(cè)方法相似的優(yōu)勢(shì)。而在不同級(jí)別宮頸病變及浸潤(rùn)癌中HPV E6/E7 mRNA有更加精確的篩檢效能和準(zhǔn)確性，尤其在CIN Ⅱ及以上組織學(xué)類(lèi)型中。這一數(shù)據(jù)將更加支持細(xì)胞學(xué)聯(lián)合HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)應(yīng)用于宮頸病變篩選和分層管理，是更為合理有效的篩查和隨訪(fǎng)方案[20]。本實(shí)驗(yàn)中統(tǒng)計(jì)數(shù)值顯示HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的特異度和靈敏度均在高值范圍，但比較發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA檢測(cè)特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值間差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能是由于本研究樣本數(shù)量有限以及入選者均為可疑宮頸病變患者本身所致的偏倚，還有待大樣本臨床資料進(jìn)一步證實(shí)。

盡管2017年中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)合中國(guó)現(xiàn)狀制定了《子宮頸癌綜合防控指南》，但目前仍存在宮頸病變篩查不規(guī)范、診療不足或過(guò)度及缺乏隨訪(fǎng)等問(wèn)題。本研究旨在為更加精確規(guī)范的適合我國(guó)國(guó)情的篩查體系提供數(shù)據(jù)參考。