靶向沉默甲基轉(zhuǎn)移酶3對前列腺癌細胞增殖、侵襲和克隆能力的影響

李顯永 趙暉 顧鵬 崔慶鵬 李同海 陳印 官潤云

昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科（昆明650032）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）已成為美國男性發(fā)病率第一的惡性腫瘤，美國癌癥協(xié)會指出2019年美國PCa 發(fā)病率將占到男性新發(fā)腫瘤的20%，其病死率達10%［1］。近年來，我國PCa 的發(fā)病率和病死率均呈持續(xù)上升的趨勢，嚴重威脅男性健康［2］。因此，繼續(xù)深入研究PCa 的病因、進展因素以及尋找新型的治療靶點顯得尤為重要。N6-甲基腺苷（m6A）是真核細胞mRNA 最常見的一種化學修飾，約為真核細胞RNA 甲基化修飾的80%［3］。研究發(fā)現(xiàn)m6A 是一種動態(tài)可逆的修飾方式，其相關(guān)蛋白包括甲基轉(zhuǎn)移酶復合體（METTL3、METTL14、WTAP），去甲基酶（ALKBH5、FTO），相應的閱讀蛋白（YTHDC、YTHDF）等［4］。在白血病、肝癌、肺癌等腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，METTL3 作為經(jīng)典的甲基轉(zhuǎn)移酶可以催化mRNA m6A 修飾形成，影響靶標mRNA 的m6A 修飾水平，參與了腫瘤的發(fā)生及進展［5-7］。肺癌中的研究還發(fā)現(xiàn)METTL3 也可以不依賴m6A 途徑，獨立催化相關(guān)腫瘤蛋白的翻譯，而影響腫瘤細胞的生物學行為［7］。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)METTL3 基因在前列腺癌組織中呈高表達，且與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展及分化相關(guān)［8］。本實驗擬通過RNA 干擾技術(shù)，靶向沉默前列腺癌細胞中的METTL3 基因，繼續(xù)探討其對前列腺癌細胞生物學行為的影響，旨在為PCa 的診治提供新的理論證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 前列腺癌DU145、PC-3 細胞均從中國科學院昆明動物研究所細胞庫購買。F12 培養(yǎng)基、FBS、Trypsin-EDTA Solution（美國Gibco 公司），實時熒光定量試劑、RIPA 裂解液（上海Sangon 公司），兔抗人METTL3 單克隆抗體（英國Abcam 公司），鼠抗GAPDH 單克隆抗體（美國Sigma 公司），脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 試劑（美國Invitrogen 公司），PVDF 轉(zhuǎn)移膜（美國Millipore 公司），CCK8-試劑盒（日本同仁化學），Transwell 小室（美國Corning公司），Matrigel（美國BD 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) DU145、PC-3 細胞使用F12 培養(yǎng)基（包含10%胎牛血清、鏈霉素100 μg/mL、青霉素100 μg/mL），置于37 ℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每3～4 天傳代1 次。

1.2.2 METTL3 siRNA 基因序列及其引物的設計和合成 由生工生物工程公司針對METTL3 基因設計并合成3 對siRNA（METTL3-1126、METTL3-1400、METTL3-1604）和1 對陰性對照序列（NC），基因序列見表1。METTL3 siRNA 引物序列，上游5′-CCCTATGGGACCCTGACA-3′；下 游：5′-TCCGAATGATGCGTTGC-3′。以GAPDH作為內(nèi)參物，上游：5′-AAAATCAAGTGGGGCGATGC-3′；下游：5′-GATGACCCTTTTGGCTCCCC-3′。

表1 METTL3 siRNA 序列Tab.1 Sequence of METTL3 siRNA

1.2.3 細胞分組和轉(zhuǎn)染 將DU145、PC-3 細胞隨機分組設置為無任何特殊處理的空白對照組（B組）、僅加轉(zhuǎn)染試劑的Mock 組（M 組），轉(zhuǎn)染陰性siRNA 干擾片段的陰性對照組（NC 組）、轉(zhuǎn)染METTL3 siRNA 干擾片段的干擾組（METTL3-1604 組、METTL3-1400 組、METTL3-1604 組）。待DU145、PC-3 細胞融合至80%～90%時，去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞2 次；加1 mL 胰酶混勻，后放置37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中1 min；后加2 mL F12 培養(yǎng)液，吹打細胞使形成單細胞懸液；采用血球計數(shù)板計數(shù)后，細胞按2 × 105/孔的濃度接種至6孔板并混勻，后置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)24 h。據(jù)LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書行Mock組、陰性對照組、干擾組的DU145、PC-3 細胞轉(zhuǎn)染，同時設立空白對照組。48 h 后收取細胞，提取各樣本的mRNA 和蛋白進行檢測。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應 各組細胞樣本分別按照Trizol 試劑盒說明書提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄程序為42 ℃30 min；85 ℃10 min；定量PCR 反應程序為95 ℃3 min；95 ℃12 s；62 ℃40 s；共40 個循環(huán)。結(jié)果以GAPDH 的Ct 值作內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法進行樣本分析。

1.2.5 Western 印跡 向各組細胞樣本中加入裂解液提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE 電泳，后行PVDF 轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入稀釋后的一抗（METTL3，1∶1 000；GAPDH，1∶10 000），4 ℃溫育條件下過夜；使用1×TBST 洗滌5次，10 min/次；加入稀釋后的二抗，室溫溫育2 h，使用1×TBST 洗滌5 次，10 min/次。最后用Super-Signal West Pico Chemiluminent Substrates 發(fā)光液、FR-1800 全功能發(fā)光及熒光生物圖像分析系統(tǒng)進行檢測，結(jié)果使用Gel-Pro Analyzer 軟件分析。

1.2.6 CCK-8增殖實驗 DU145、PC-3細胞融合至80%～90%時，使用血球計數(shù)板計數(shù)，以3 × 103/孔的濃度接種至96 孔板。同時設置調(diào)零組，每組設5個重復，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔避光加入CCK-8 5 μL，培養(yǎng)2 h，后酶標儀450 nm 波長測光密度值（OD值），標記為0 h。轉(zhuǎn)染后各組細胞樣本分別于24、48、72 h 后避光加入CCK-8，避光培養(yǎng)2 h，后酶標儀450 nm 波長測OD值，并繪制不同分組細胞生長曲線。

1.2.7 Transwell 侵襲實驗 以含0.5% FBS 的F12培養(yǎng)液按1∶6 稀釋50 mg/L Matrigel，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，棄上清。將轉(zhuǎn)染48 h后各組細胞樣本以1×103/孔的濃度轉(zhuǎn)移至transwell 小室，下室為20%血清濃度的F12 培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。取出小室，加入預冷甲醇，于-20 ℃固定10 min。后用棉簽刮去小室上表面Matrigel 膠，倒置風干。將小室置入新的24-well 中，以0.1%結(jié)晶紫染色30 min，清洗晾干后，于倒置顯微鏡下隨機取視野拍照并計數(shù)。

1.2.8 平板克隆形成實驗 各組細胞轉(zhuǎn)染48 h后，按300 細胞/孔的濃度接種至6 孔板，輕輕晃動，使細胞均勻散開，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至完全貼壁。每2 ～3 天觀察細胞生長狀況，第15 天出現(xiàn)肉眼可見的克隆，培養(yǎng)終止。棄上清，PBS洗滌2次，后加入4%多聚甲醛2 mL，4 ℃，固定20 min。棄固定液，PBS 洗1 次，加0.1%結(jié)晶紫1 mL，37 ℃，染色30 min。后洗去染液，風干，后肉眼計數(shù)克隆，顯微鏡拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析。計量資料結(jié)果以均數(shù)±標準差表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用LSD-t法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 實時熒光定量聚合酶鏈反應 細胞轉(zhuǎn)染48 h后，DU145、PC-3 細胞各組METTL3 mRNA 表達量見圖1、2。3 條siRNA 均能有效的降低METTL3 mRNA的表達。Mock組與空白對照組、陰性對照組比較METTL3 mRNA 表達差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明轉(zhuǎn)染試劑對前列腺癌細胞METTL3 mRNA 表達無明顯影響。DU145 中siRNA-1400 組表達量分別為兩對照組的10%、9%，干擾效率分別為90%和91%，差異有統(tǒng)計學意義（F=618.246，P＜0.01）。PC-3 細胞中siRNA-1400 組表達量分別為兩對照組的28%、27%，干擾效率分別為72%和73%，差異有統(tǒng)計學意義（F=114.878，P＜0.01）。

圖1 DU145 細胞以B 為校準GAPDH 為內(nèi)參METTL3 mRNA 表達水平Fig.1 B-calibrated GAPDH for internal reference METTL3 mRNA expression level in DU145 cells

圖2 PC-3 細胞以B 為校準GAPDH 為內(nèi)參METTL3 mRNA 表達水平Fig.2 B-calibrated GAPDH for internal reference METTL3 mRNA expression level in PC-3 cells

2.2 Western印跡 DU145、PC-3細胞干擾組中3條siRNA 對METTL3 蛋白的表達干擾情況見圖3、4。與空白對照組、陰性對照組比較，Mock 組METTL3蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），結(jié)合以上Mock 組METTL3 mRNA 表達情況說明轉(zhuǎn)染試劑未對METTL3 基因表達產(chǎn)生顯著影響，后續(xù)實驗采用空白對照組、陰性對照組、干擾組3 組間相互比較。其中DU145、PC-3 細胞的siRNA-1400 組METTL3蛋白的表達較兩對照組顯著降低，F(xiàn)DU145= 53.607，PDU145＜0.01；FPC-3=7 878.320，PPC-3＜0.01。DU145中siRNA-1400 組表達量分別為兩對照組的12.8%、14.3%，干擾效率分別為87.2%和85.7%。PC-3 細胞中siRNA-1400 組表達量分別為兩對照組的2.2%、2.3%，干擾效率分別為97.8%和97.7%。siRNA-1400片段轉(zhuǎn)染DU145、PC-3 細胞后METTL3蛋白的表達與前面mRNA 表達情況相符，具有較高的干擾效率，后續(xù)選用該片段干擾進行實驗。

圖3 DU145 細胞各組METTL3 蛋白表達水平Fig.3 METTL3 protein expression in DU145 cells

圖4 PC-3 細胞各組METTL3 蛋白表達水平Fig.4 METTL3 protein expression in PC-3 cells

2.3 CCK-8 實驗 CCK-8 增殖曲線反映了多個時間點DU145、PC-3 細胞不同組間的增殖情況，見圖5。24、48、72 h DU145 細胞干擾組的OD值均顯著低于兩對照組（F24h= 25.099，P＜0.01；F48h=8.464，P＜0.01；F72h=18.705，P＜0.01）。24、48、72 h PC-3 細胞干擾組的OD值同樣顯著低于兩對照組（F24h= 15.719，P24h＜0.01；F48h= 11.082，P48h＜0.01；F72h= 8.937，P72h＜0.01）。提示下調(diào)METTL3 基因表達后明顯抑制了前列腺癌細胞的增殖能力。

圖5 下調(diào)METTL3 對前列腺癌細胞增殖能力的影響Fig.5 Effect of down-regulation of METTL3 on proliferation of prostate cancer cells

2.4 Transwell 實驗 DU145、PC-3 細胞轉(zhuǎn)染48 h后，各組穿過Matrigel 基膜情況見圖6。DU145細胞干擾組穿過基膜細胞數(shù)（7.667 ± 2.082），顯著低于空白對照組（46.333±5.132）和陰性對照組（46.667± 4.726），差異具有統(tǒng)計學意義（F= 85.365，P＜0.01）。PC-3 細胞干擾組穿過基膜細胞數(shù)（58.667± 1.528），顯著低于空白對照組（80.333± 4.726）和陰性對照組（90.333 ± 4.041），差異具有統(tǒng)計學意義（F=57.520，P＜0.01）。由此可見，下調(diào)METTL3基因顯著地抑制了DU145、PC-3細胞的侵襲能力。

2.5 平板克隆形成實驗 DU145、PC-3 細胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)15 d，克隆成形情況見圖7。DU145細胞空白對照組、陰性對照組，干擾組克隆數(shù)分別為：（166.333±5.508）、（172.667±2.082）、（77.667±6.807），結(jié)果顯示干擾組克隆數(shù)明顯低于兩對照組（F=331.461，P＜0.01）。PC-3 細胞空白對照組、陰性對照組，干擾組克隆數(shù)分別為：（458.000 ±22.338）、（455.333 ± 18.610）、（403.667 ± 8.083），結(jié)果表明干擾組克隆數(shù)明顯低于兩對照組（F=9.271，P＜0.05）。

3 討論

圖6 下調(diào)METTL3 對前列腺癌細胞侵襲能力的影響（×400）Fig.6 Effect of down-regulation of METTL3 on invasion of prostate cancer cells（×400）

圖7 下調(diào)METTL3 對前列腺癌細胞克隆形成的影響Fig.7 Effect of down-regulation of METTL3 on colony formation of prostate cancer cells

m6A 是一種發(fā)生于腺嘌呤第六位氮原子上的甲基化修飾方式。在哺乳動物中，平均每條RNA大約存在3 ～5 個m6A 的修飾位點［9］。研究表明m6A 的修飾可能參與了mRNA 的剪切、加工、出核、翻譯效率、穩(wěn)定性，從而與多種生物學功能有著深入的關(guān)聯(lián)，涉及晝夜節(jié)律、DNA損傷修復、性別的決定、組織發(fā)育和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等［4，10］。最新研究［11］發(fā)現(xiàn)甲基轉(zhuǎn)移酶復合體中只有METTL3具有催化核心，可以接受S-腺苷甲硫氨酸（SAM）為m6A 修飾提供甲基，與METTL14、WTAP 相互協(xié)作催化m6A 修飾形成，因此認為METTL3 是m6A 修飾形成的限速酶，對RNA 的m6A 修飾水平具有重要影響。學者［5-6］通過TCGA 數(shù)據(jù)集資料分析以及筆者前期的研究［8］結(jié)果均證實PCa 中METTL3 基因呈高表達，且表達水平與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展及分化緊密相關(guān)。

本實驗通擬過RNA 干擾技術(shù)下調(diào)DU145、PC-3 細胞中的METTL3 基因表達，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染METTL3 siRNA-1400 干擾片段48 h 后，前列腺癌DU145、PC-3細胞中的METTL3 mRNA及其蛋白表達均呈現(xiàn)顯著地下調(diào)，說明特異性的METTL3 siRNA能夠有效抑制前列腺癌細胞中內(nèi)源性METTL3 的表達。進一步對轉(zhuǎn)染后前列腺癌細胞生物學行為研究發(fā)現(xiàn)，METTL3-siRNA 干擾組前列腺癌細胞的增殖、侵襲、克隆形成能力均明顯低于兩對照組，說明下調(diào)METTL3 基因?qū)⒁种魄傲邢侔┘毎脑鲋?、侵襲、克隆能力，METTL3 是影響前列腺癌細胞生物學行為的重要基因。

肺癌細胞中發(fā)現(xiàn)METTL3 在細胞核和細胞質(zhì)中均有分布，研究表明METTL3 與其他甲基轉(zhuǎn)移酶共同催化了腫瘤基因EGFR、TAZ、MAPKAPK2（MK2）和DNMT3A mRNA 的m6A 修飾，從而促進相關(guān)腫瘤基因的翻譯，增加其蛋白表達；同時細胞質(zhì)中的METTL3 不依賴其他甲基化相關(guān)酶，獨立與核糖體結(jié)合而促進目的基因的翻譯；進一步下調(diào)METTL3 基因表達后，明顯抑制了肺癌細胞增殖、侵襲力，并增加細胞的凋亡［7］。在白血病的研究中也發(fā)現(xiàn)，高表達的METTL3 促進了c-MYC，BCL-2和PTEN 癌基因的表達，是維持白血病細胞增殖生長所必須的因素，敲低后癌細胞增殖能力則明顯下降［12］。肺癌和白血病的研究中，METTL3 調(diào)控的腫瘤基因EGFR、c-MYC、BCL-2 也是與前列腺癌關(guān)系密切的癌基因，由此推測METTL3 可能也通過調(diào)控前列腺癌的腫瘤基因，進而影響了前列腺癌細胞的生物學行為。此外METTL3 在膠質(zhì)母細胞瘤［13］、乳腺癌［14］的研究中均表現(xiàn)出促癌作用。METTL3 在腫瘤中通過m6A 修飾途徑或者獨立促進某些癌基因的表達，在腫瘤中發(fā)揮促癌基因的作用，下調(diào)METTL3 后腫瘤細胞的增殖、侵襲、克隆能力受到明顯的抑制，并增加腫瘤細胞凋亡。這與本實驗中下調(diào)前列腺癌細胞METTL3 基因表達，將抑制前列腺細胞生物學行為的結(jié)果一致。當然，在少數(shù)腫瘤，例如腎癌［15］和宮頸癌［16］的研究發(fā)現(xiàn)METTL3 基因發(fā)揮抑癌作用。

GU 等［17］發(fā)現(xiàn)METTL3 可能參與了由亞砷酸鹽誘導的腫瘤發(fā)生，下調(diào)其表達并可逆轉(zhuǎn)細胞惡性表型，可能是腫瘤治療的一個新靶點。膠質(zhì)母細胞瘤的研究還表明m6A 修飾介導了DNA 損傷的修復，敲低METTL3 后腫瘤細胞對放療的敏感性增加［13］。另有研究［18］也發(fā)現(xiàn)下調(diào)METTL3 基因后，胰腺癌細胞對順鉑、5-氟尿嘧啶、吉西他濱等化療藥物以及放療具有更高的敏感性。綜上，METTL3也可能是前列腺癌治療的一個新型靶點。

本研究證明了METTL3基因在雄激素非依賴性前列腺癌細胞系（DU145、PC-3）中的功能性以及重要性，為PCa 的治療提供了一個新型分子靶點。本實驗后續(xù)將增加前列腺癌細胞系種類，繼續(xù)探討METTL3 對前列腺癌細胞生物學行為的影響，同時檢測相關(guān)腫瘤蛋白的表達情況，并探討其機制。