中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)促進(jìn)腫瘤局部生長(zhǎng)

夏 杰，倪 浩，湯 靜，胡 倩

( 黃岡職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)藥學(xué)院，湖北 黃岡 438002)

中性粒細(xì)胞是人體防御機(jī)制的第一道防線，是機(jī)體發(fā)揮天然免疫功能的主要細(xì)胞。中性粒細(xì)胞缺乏的患者免疫功能嚴(yán)重缺失，往往在年輕時(shí)死于細(xì)菌或真菌感染。然而中性粒細(xì)胞過(guò)度活化可導(dǎo)致大量活性氧和促炎細(xì)胞因子等細(xì)胞毒性介質(zhì)的釋放，可直接或間接損傷內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[1]。2004 年，Brinkmann V[2]等發(fā)現(xiàn)了一種新的中性粒細(xì)胞防御機(jī)制，當(dāng)病原體入侵時(shí)，中性粒細(xì)胞釋放出網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，將病原體捕獲并殺滅。這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)稱為中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps ，NETs)，其化學(xué)組成主要是染色質(zhì)DNA 和蛋白質(zhì)。DNA 是NETs 的基本骨架，多種蛋白質(zhì)充斥其中，如組蛋白和胞內(nèi)顆粒釋放出來(lái)的各種抗菌肽[3]。網(wǎng)狀骨架可以限制捕獲病原體，各種蛋白參與殺滅病原體。NETs 形成常伴隨細(xì)胞的死亡，這一過(guò)程稱為NETosis。這種死亡不同于凋亡和壞死，其最顯著的特點(diǎn)是細(xì)胞核核膜的崩解，染色質(zhì)的膨脹和去致密作用[3]。NETs 起初被單純的認(rèn)為是中性粒細(xì)胞誘捕和殺死病原體的一種手段，然而后來(lái)發(fā)現(xiàn)過(guò)度的NETs 形成還參與許多疾病的病理過(guò)程，如血栓形成、子癇前期、慢性炎癥性疾病以及心肌梗死后的缺血再灌注損傷等。 然而，近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)NETs 與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，這也成為癌癥研究中的一個(gè)新的熱點(diǎn)。Ho-Tin-Noe B 等[4]在Lewis 肺癌小鼠模型身上的一項(xiàng)研究顯示有腫瘤相關(guān)的中性粒細(xì)胞以及細(xì)胞外染色質(zhì)在腫瘤組織中積累，提示腫瘤中存在NETs 形成。2013 年Berger-Achituv S 等[5]在一個(gè)基于小樣本尤文氏肉瘤的研究中觀測(cè)到，腫瘤組織內(nèi)NETs 水平升高的患者預(yù)后較差，這是NETs與人類癌癥惡化相關(guān)的第一個(gè)證據(jù)。我們知道NETs 的成分除了染色質(zhì)DNA 外，還有包括眾多種類蛋白質(zhì)，如組蛋白和各種胞內(nèi)顆粒釋放蛋白。許多研究證實(shí)這些蛋白質(zhì)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本文將重點(diǎn)討論NETs 及其產(chǎn)物在腫瘤局部生長(zhǎng)和進(jìn)展中的作用相關(guān)研究的最新進(jìn)展。

1 中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（NE）

NE 主要儲(chǔ)存在于中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒中，當(dāng)中性粒細(xì)胞進(jìn)入NETosis 程序時(shí)，NE 隨著NETs 一起釋放出來(lái)。NE 是一種強(qiáng)效廣譜蛋白酶，有許多底物，包括細(xì)胞外幾乎所有基質(zhì)蛋白。Kolaczkowska E 等[6]對(duì)血液感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌小鼠模型的肝臟進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示NE 結(jié)合于NETs，并展示出較強(qiáng)的蛋白水解活性和組織損傷效應(yīng)。Houghton AM 等[7]觀測(cè)了NE缺陷和非NE 缺陷的肺腺癌小鼠模型，發(fā)現(xiàn)NE缺陷小鼠腫瘤負(fù)荷及死亡率顯著降低，并證實(shí)NE 可進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)體間室，通過(guò)降解胰島素受體底物-1 (IRS-1)直接誘導(dǎo)人類和小鼠肺腺癌的腫瘤細(xì)胞增殖。Wada Y 等[8]通過(guò)MTT 比色法證明了NE 促進(jìn)食管細(xì)胞增值，并通過(guò)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)證明了NE 可以增強(qiáng)食管細(xì)胞的侵襲性。 他們?cè)谑彻馨┘?xì)胞培養(yǎng)體系中加入外源性NE，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)體系中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α（TGF-α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF）的濃度顯著增加，而這些因子可以促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖和遷移。一種特殊的NE抑制劑西維來(lái)司鈉（Sivelestat）可以抑制這一現(xiàn)象。這些結(jié)果表明，活化中性粒細(xì)胞釋放的NE通過(guò)生長(zhǎng)因子刺激食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和進(jìn)展，而特異性NE 抑制劑sivelestat 可以阻斷這些過(guò)程。Gaida MM 等[9]在胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞與多形核白細(xì)胞共培養(yǎng)過(guò)程中也觀察到NE 對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移有促進(jìn)作用。因此，有學(xué)者建議將Sivelestat 作為一種新的分子靶向癌癥治療手段。

2 基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）

除了NE，NETs 的其他成分也與腫瘤進(jìn)展、腫瘤相關(guān)炎癥和血管生成有關(guān)。MMP-9 就是研究得較深入的例子之一。MMP-9 屬于基質(zhì)金屬蛋白酶超家族成員中明膠酶的一種,又稱明膠酶B，由包括中性粒細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞類型表達(dá)。MMP-9 儲(chǔ)存在中性粒細(xì)胞的三級(jí)顆粒中，當(dāng)中性粒細(xì)胞進(jìn)入NETosis 程序時(shí)，MMP-9 可隨著染色質(zhì)DNA 釋放出來(lái)。其主要功能是降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì), 在傷口愈合、細(xì)胞遷移或血管生成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。另外MMP-9 也參與人體許多病理過(guò)程，Martinod K 等[10]通過(guò)觀測(cè)膿毒癥小鼠模型的相關(guān)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)MMP-9 缺陷對(duì)小鼠內(nèi)毒素休克具有保護(hù)作用。更重要的是，MMP-9 還與腫瘤的局部生長(zhǎng)有關(guān)，Acuff HB 等[11]將Lewis 肺癌腫瘤細(xì)胞接種至野生型和MMP-9缺陷小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)， MMP-9 缺陷小鼠腫瘤細(xì)胞負(fù)荷相對(duì)于野生型低81%；他們還通過(guò)生物熒光成像技術(shù)檢測(cè)了MMP-9 缺陷對(duì)小鼠腫瘤負(fù)荷影響的時(shí)間效應(yīng)，結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞注入MMP-9 缺陷小鼠6 小時(shí)以內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡率是對(duì)照組的4 倍。Coussens LM 等[12]利用HPV16 致癌基因誘導(dǎo)的小鼠皮膚癌模型研究了MMP-9 對(duì)腫瘤的影響，結(jié)果顯示MMP-9 在血管異常增生和侵襲性表皮癌的小鼠模型中顯著上調(diào)，而MMP-9 缺陷小鼠腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移均有所降低。這些數(shù)據(jù)表明，MMP-9 有助于腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)、進(jìn)展以及腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。Bergers G 等[13]很早就發(fā)現(xiàn)，胰島癌變轉(zhuǎn)基因小鼠模型MMP-9 上調(diào)，并通過(guò)釋放VEGF 促進(jìn)胰島癌血管生成。而且，MMP-9 抑制劑可減少血管生成和腫瘤數(shù)量。因此，MMP-9 似乎對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)釋放VEGF 非常重要，從而促進(jìn)腫瘤的血管生成開關(guān)的開啟。

以上研究多為單純MMP-9 對(duì)腫瘤的效應(yīng)，但與NETs結(jié)合的MMP9 是否也能傳遞這些效應(yīng)，還需要進(jìn)一步研究。

3 白細(xì)胞介素8（IL-8）

中性粒細(xì)胞能夠產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子,包括TNFα、IL-12 或IL-8。Gupta AK 等[14]很早就證實(shí)IL-8 可以激活子癇前期患者的中性粒細(xì)胞并引發(fā)NETosis 和NETs 形成。 他們后期的另外一項(xiàng)研究，中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用對(duì)NETosis 的影響，發(fā)現(xiàn)IL-8 與NETs 形成、血管生成以及中性粒細(xì)胞的募集密切相關(guān)[15]。Wang J等[16]將間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)與結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)IL-8 在間充質(zhì)肝細(xì)胞的表達(dá)高度上調(diào)。他們發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)細(xì)胞分泌的IL-8 促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的增殖和遷移，進(jìn)而促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞成管能力和結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)能力。另外，已知IL-8 與其受體CXCR1/2 之間的交互作用在癌癥的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。Reparixin 和SCH527123 是CXCR1/2 高效拮抗劑，Shengling Fu 等[17]發(fā)現(xiàn)Reparixin 或SCH527123 對(duì)多種人胰腺癌細(xì)胞株產(chǎn)生了劑量依賴性的生長(zhǎng)抑制作用。因此，IL-8 支持實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)也已得到共識(shí)，由于NETs 本身就會(huì)創(chuàng)造促炎環(huán)境，募集更多的中性粒細(xì)胞，而形成新的NETs，釋放更多的IL-8，從而構(gòu)成一個(gè)惡性循環(huán)，進(jìn)行性促進(jìn)血管生成和腫瘤生長(zhǎng)。

4 粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）

Demers M 等[18]早已提出腫瘤可通過(guò)釋放G-CSF 激發(fā)中性粒細(xì)胞形成NETs，并在在腫瘤微環(huán)境中檢測(cè)到NETs 的存在。肽?；彼崦搧啺泵?（PAD4）催化染色質(zhì)組蛋白瓜氨酸化，進(jìn)而染色質(zhì)解凝，這是NETs 形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Demers M 等[19]在后期又進(jìn)行了一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，他們利用pad4 缺陷小鼠模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)，G-CSF 通過(guò)激發(fā)中性粒細(xì)胞啟動(dòng)NETosis 程序促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，并發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生G-CSF 時(shí)，PAD4 缺陷才能阻止腫瘤的進(jìn)展。顏彬等[20]最近的一項(xiàng)研究證實(shí)，G-CSF 能夠激活荷瘤小鼠骨髓中性粒細(xì)胞形成NETs，并促進(jìn)U14 宮頸癌血管生成和腫瘤的生長(zhǎng)；阻斷G-CSF 作用，荷瘤小鼠骨髓中性粒細(xì)胞促瘤作用消失，如果用DNA 酶Ⅰ干擾NETs 形成，僅能部分消除荷瘤小鼠骨髓中性粒細(xì)胞促瘤作用。因此，G-CSF 可能是通過(guò)多途徑發(fā)揮其促瘤作用。

綜上所述，NETs 雖然是中性粒細(xì)胞發(fā)揮其天然免疫的重要手段，但在腫瘤免疫方面卻表現(xiàn)出更多的促腫瘤作用，NETs 及其相關(guān)產(chǎn)物通過(guò)各種途徑促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。隨著這些作用機(jī)制不斷闡明，我們對(duì)腫瘤的天然免疫應(yīng)答機(jī)制的認(rèn)識(shí)也不斷深入，并為設(shè)計(jì)新的抗腫瘤治療策略提供理論依據(jù)。