細菌生物膜引起致病菌耐藥機制及抗菌肽LL-37對生物膜作用的研究進展

魏建仝 錢 軍* 蘇秦柳曄 劉志俠 王徐龍 王勇平 謝瑞敏 李 想

（1.河西學院附屬張掖人民醫(yī)院；2.河西學院臨床醫(yī)學院；3.河西學院骨與關節(jié)研究所；4.張掖市骨科質量控制中心，甘肅 張掖 734000；5.蘭州大學第一醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

人工關節(jié)置換術后PJI發(fā)生率約1%，是其災難性并發(fā)癥［1］.因PJI導致髖關節(jié)置換失敗而需翻修的比例約15%，在膝關節(jié)更高達約25%，嚴重影響患者健康［2］.盡管隨著層流手術室的普及、術中無菌觀念及技術的進步、關節(jié)假體表面的改性、術中抗生素骨水泥的應用、術后預防性使用抗生素、感染傷口的更有效處理等使術后PJI的發(fā)生率下降，但隨著我國人口的老齡化，人工關節(jié)置換術開展總量增多，術后PJI的發(fā)生量亦隨之增加［3］.高川渤等［4］分析引起術后PJI的病原菌譜，耐藥的高毒力革蘭陰性細菌占62.54%.致病菌定植黏附于假體表面形成生物膜，在PJI致病機制中扮演著重要角色并使得PJI 遷延難愈，治療困難.LL-37 作為Cathelicidin 家族的一員，具有來源廣泛、抗菌譜廣、抗菌活性強和不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點［5］.本文對生物膜引起致病菌耐藥機制及抗菌肽LL-37對生物膜的抑制作用進行綜述.

1 生物膜與致病菌耐藥

1.1 臨床致病菌耐藥現(xiàn)狀及與生物膜關聯(lián)性

大樣本數(shù)據(jù)表明骨科臨床感染致病菌金黃色葡萄球菌（SA）中59%為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）［6］.左祥等［7］報道SA對甲氧芐啶和慶大霉素的耐藥率為70.27%和24.32%.錢衛(wèi)東等［8］研究70例臨床來源的SA的耐藥性和生物膜形成能力，結果菌株對青霉素耐藥率為95.71%，對苯唑西林耐藥率為74.29%，對克林霉素耐藥率為52.86%，對利奈唑胺耐藥率為27.14%，對甲氧芐啶耐藥率為21.43%，對慶大霉素耐藥率為2.86%，對環(huán)丙沙星耐藥率為21.43%，對頭孢唑啉耐藥率為37.14%，對哌拉西林耐藥率為38.57%，菌株中25.71%為耐藥菌株，71.43%為多重耐藥菌株，表明SA多重耐藥情況嚴重.而菌株成膜能力結果表明所有SA菌株均能形成生物膜，且其中強生物膜菌株占71.43%、中等強度生物膜菌株占18.57%，提示SA有普遍且強烈的生物膜形成能力.

致病菌黏附于假體表面形成高度組織化的膜樣聚合物并包繞致病菌自身，在生物膜的保護下膜內(nèi)致病菌對微環(huán)境壓力、對抗菌藥物的殺滅能力及對宿主免疫系統(tǒng)攻擊的耐受力均增強，提高其耐藥性，其較浮游態(tài)菌提高10～1000倍.可見生物膜是導致PJI早期難明確診斷，治療難保留假體，治療后反復感染、持續(xù)感染的關鍵因素之一［9，10］.

1.2 耐藥機制

1.2.1 屏障作用

（1）生物膜為一復雜的、高度組織化的三維網(wǎng)狀結構且成熟后有一定厚度，結構穩(wěn)定不易被破壞，其形成膜內(nèi)致病菌的物理屏障.（2）三維網(wǎng)狀結構內(nèi)部為迂曲通道，是抗菌藥物大分子進入膜內(nèi)受限、受阻的原因之一［11］.（3）即使抗菌藥物進入膜內(nèi)，其擴散速度受到明顯影響，深層致病菌甚至接觸不到抗菌藥物.（4）生物膜為帶負電的POPG膜（1-棕櫚酰基-2-油?；字８视停芪斩嚯逆溨袔д姾傻陌被鶄孺?，構成電荷屏障，阻礙親水性抗菌藥物進入菌體發(fā)揮殺菌作用，降低抗菌藥物的殺滅能力［12］.（5）生物膜聚合物發(fā)揮分子篩選效應，增加抗菌藥物的最低抑菌濃度（MIC），提高致病菌的耐藥性［13］.總之，生物膜通過對抗菌藥物的屏障，對膜內(nèi)致病菌起到保護作用，增加感染治療難度.

1.2.2 微環(huán)境調節(jié)

生物膜具有不均質性，呈分層結構，膜不同層面微環(huán)境存在差異，使不同層面的致病菌理化特性差異顯著.Lenz等［14］發(fā)現(xiàn)生物膜分表里兩層，表層致病菌代謝活躍、分裂快，里層則反之.黃曉晶等［15］通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察亦發(fā)現(xiàn)抗菌藥物對生物膜外各時段變異鏈球菌（SM）均有殺傷作用，但對膜內(nèi)深層SM僅在早期產(chǎn)生影響（3h）.分層結構使得自膜外向內(nèi)營養(yǎng)成分、代謝產(chǎn)物濃度、滲透壓和氧濃度等呈梯度下降，膜內(nèi)為低營養(yǎng)物質、低氧濃度微環(huán)境，深層致病菌很難獲得養(yǎng)分和氧氣，酸性代謝產(chǎn)物堆積，代謝活性低甚至處于休眠狀態(tài)，對各種理化刺激、應激反應及藥物均不敏感，使得感染難以控制［15］.

1.2.3 QS系統(tǒng)作用

致病菌通過互相傳遞信息素調節(jié)自身基因表達使其黏附、聚集、形成完整生物膜，當膜內(nèi)菌種群密度達到閾值時細菌群體感應系統(tǒng)（QS系統(tǒng)）會使一部分致病菌從膜內(nèi)脫離.唐婕［16］的研究表明鮑曼不動桿菌（AB）的QS 系統(tǒng)由AbaI/AbaR 二組分系統(tǒng)組成，77.5%的臨床株攜帶AbaI 及AbaR 基因，與AB 耐藥顯著相關且表現(xiàn)出更強的細胞侵襲能力.PA 的QS 系統(tǒng)包括LasI/LasR 信號系統(tǒng)、RhlR 信號系統(tǒng)與喹諾酮信號分子（PQS），三者相互關聯(lián)調控誘導產(chǎn)生細胞因子，進而調節(jié)免疫應答提高自身生存能力并調控生物膜黏附、群聚、形成等生物學行為增加耐藥性［17，18］. 總之，QS系統(tǒng)使致病菌由膜內(nèi)態(tài)轉換為浮游態(tài)，導致感染擴散或復發(fā).

1.2.4 激活應激反應

應激反應也稱SOS反應，指致病菌DNA受到嚴重損傷時多種基因誘導的DNA修復以維持DNA的完整性.劉敏［19］的PA 抑菌實驗表明，低于MIC 劑量的抗生素在短時間內(nèi)就會引起PA 的SOS 反應.其機制是致病菌DNA受損后與激活蛋白（RecA）結合，結合后促使阻遏蛋白（LexA）發(fā)生自我切割，然后SOS 修復酶類相繼合成，即SOS 反應激活一系列基因轉錄，使膜內(nèi)細菌適應低營養(yǎng)、低氧濃度、代謝酸性產(chǎn)物堆積的微環(huán)境并維持活力；此外，SOS 反應被激活時亦可增強QS 系統(tǒng)增強.總之，激活應激反應后啟動一系列保護機制，促進生物膜生成，增強膜內(nèi)致病菌耐藥性，不利于根治感染.

1.2.5 啟動外排泵系統(tǒng)

外排泵系統(tǒng)是膜內(nèi)致病菌的一種自我保護手段.趙亞運等［20］檢測26株臨床分離的多重耐藥鮑曼不動桿菌（MDRAB）對18 種常用抗菌藥物的MIC，PCR 擴增adeB、adeJ、macB、emrB、abeS、abeM、craA 外排泵基因，實時熒光定量RT-PCR 檢測外排泵基因的mRNA 表達水平，結果adeJ和abeM的檢出率達100%，abes、adeB、craA的檢出率分別為96.15%、92.31%、84.62%，macB、emrB檢出率在80%以上，認為外排泵基因可引起B(yǎng)A廣泛的、多重耐藥性.劉獻清等［21］的研究表明BA耐藥結節(jié)化細胞分化家族（RND）外排泵基因adeB、adeB-like、adeFGH、adeIJK 對BA 耐藥性具有不同程度影響，其中adeB對BA的耐藥性影響最明顯.總之，外排泵系統(tǒng)通過及時排除透膜抗菌藥物，避免膜內(nèi)致病菌與之接觸，降低抗菌藥物的殺菌作用，增強膜內(nèi)致病菌的耐藥性.

1.2.6 影響機體免疫

（1）生物膜基質成分遮蓋致病菌相關分子，使中性粒細胞無法激活［22］；（2）在有生物膜存在的情況下中性粒細胞從骨髓或周圍血管中向感染部位遷移的趨化作用減弱［22］；（3）Thurlow 等［23］研究發(fā)現(xiàn)SA生物膜菌株能夠阻斷巨噬細胞對SA進行識別的經(jīng)典Toll樣受體2（TLR2）和TLR9途徑；減少巨噬細胞炎性介質的產(chǎn)生和對生物膜的攻擊；巨噬細胞誘生一氧化氮合酶（iNOS）表達下降，反應性M2 巨噬細胞增多但抗菌活性很低.因此，在生物膜存在情況下巨噬細胞雖仍有一定吞噬能力，但較低的iNOS 表達說明其對胞內(nèi)致病菌的殺傷能力大大減弱；（4）生物膜的抵抗性使機體無法識別致病菌表達的一系列病原相關分子，使致病菌無法及時清.總之，生物膜通過抑制、降低相關免疫細胞的表達，降低其對致病菌的殺滅，導致感染遷延不愈；而持續(xù)存在的致病菌刺激機體免疫，導致過于強烈的促炎反應，造成組織損傷［22］.

2 抗菌肽LL-37與生物膜

2.1 抗菌肽LL-37結構及抑制生物膜作用

抗菌肽LL-37是Cathelicidins家族的唯一成員，因包含37個氨基酸殘基，N端前兩個氨基酸殘基為亮氨酸（L）而得名組成，分子式為C205H340N60O53，分子量約4.5KD，pH中性條件下帶6個靜正電荷，中間2～31個氨基酸形成一個長的雙親性螺旋結構［24］.其活性片段集中在5～32位的氨基酸殘基部位，30%活性片段是在13位異亮氨酸附近被水解而形成.其二級結構含有75.7%的α螺旋和24.3%的無規(guī)則卷曲，親水性基團和疏水性基團呈對稱性分布兩側，C端和N端形成親水性和疏水性區(qū)域［25］.丁靜等［26］運用微量肉湯稀釋法測定LL-37對臨床MRSA菌株的MIC為12.5μmol/L；在0.625μmol/L（僅1/20MIC）作用濃度下，LL-37對MRSA臨床株生物膜的抑制活性即為27%，而當用藥濃度達到3.13μmol/L（僅1/4MIC）時，LL-37對MRSA生物膜形成的抑制率達63%；激光共聚焦顯微鏡掃描結果發(fā)現(xiàn)LL-37能減少生物膜成熟，使其結構疏松，厚度為（5±2）μm，僅為對照組1/4，明顯偏薄，有較強的抑制MRSA生物膜形成作用.史鵬偉等［27］的研究也表明抗菌肽LL-37作用后，AB成熟生物膜結構被破壞；當LL-37濃度為2.5μg/ml時即可破壞生物膜結構，且隨著LL-37濃度增加生物膜形成量逐漸減少.總之，抗菌肽LL-37不僅能殺滅浮游態(tài)致病菌還能抑制生物膜的形成、破壞已形成的生物膜，表現(xiàn)出“內(nèi)源性抗菌素”的作用.

2.2 作用機制

2.2.1 地毯模型機制

目前較公認的LL-37殺菌模式為“地毯模型”［25］.LL-37中間的雙親性螺旋結構在中性PH下帶6個正電荷.生物膜表面是磷脂的親水頭部與膜外部基質接觸，帶負電荷［28］.在靜電作用下正負電荷吸引在生物膜表面排列，親水頭部朝向磷脂頭部基團，形成“地毯”狀，當分子排列達到飽和后，LL-37發(fā)生轉動使疏水基朝向膜的磷脂尾部集團，破壞脂質雙層結構，使細胞膜破裂.毛文超等［28］用分子動力學模擬的方法研究LL-37與帶負電的POPG膜在原子水平的相互作用，結果顯示LL-37的核心肽段FK-13（殘基肽段17～29）離膜的質心距離從4nm縮小到2.5nm左右，F(xiàn)K-13會自發(fā)插入到膜的頭基部分但并不會較深的插入到膜的內(nèi)部，三維結構圖顯示FK-13會像地毯一樣覆蓋在膜的表面，并有部分殘基插入膜，F(xiàn)K-13保持了部分螺旋構象，與上述結論符合.

2.2.2 擾動機制

Frances Neville 等［29］研究了LL-37 與模擬人類紅細胞的細胞膜模型（DPPC、DPPE）、LL-37 與模擬生物膜模型（DPPG）的作用，結果沒有觀察到LL-37與DPPC、DPPE發(fā)生顯著的相互作用，但觀察到LL-37以“地毯模型”機制插入到DPPG模型中，提出LL-37破壞生物膜是通過膜擾動的“地毯機制”.所謂膜擾動是LL-37 覆蓋生物膜表面，直接導致膜破裂或形成環(huán)形孔.毛文超等［30］觀察FK-13與POPG相互作用前后膜的脂質序參數(shù)，該參數(shù)通過脂質Sn1鏈中?；湹奶荚拥臄_動來表征，可用來描述FK-13在結合到膜上時對膜的擾動情況，數(shù)值越大說明對膜的擾動越大，對膜的破壞就越大.結果FK-13在未接觸到膜時的脂質序參數(shù)值要顯著小于接觸后的值，說明FK-13在結合到膜后對膜的擾動增加，并產(chǎn)生破壞作用.

2.2.3 跨膜孔洞機制

Lee等［31］指出，LL-37與生物膜的結合分兩種情況，其一是以中間的雙親性螺旋結構平行于膜的表面，以“地毯模型”機制破壞生物膜.其二是LL-37引起跨膜孔的形成，其隨著LL-37雙親性螺旋方向調整到大致與膜的表面垂直，跨膜孔的半徑為23～33?，形成跨膜孔的條件是雙層膜的間隔大于70?.但Alessio Bonucci 等［32］的研究指出LL-37 與帶負電膜的相互作用是通過形成穩(wěn)定的類似于環(huán)形孔的聚集體結構，而與中性膜發(fā)生相互作用時形成更高濃度的低聚物結構，可見其對膜的破壞過程機制復雜.

2.2.4 抑制致病菌觸顫活動機制

LL-37 可通過抑制治病菌的觸顫作用來影響生物膜的形成.丁靜等［26］的研究中僅僅1/4MIC 的LL-37 對MRSA 臨床株生物膜的抑制活性即可達到63%，且可減少生物膜生成，并使膜的結構疏松，厚度變薄，缺少成熟生物膜的特征性結構.史鵬偉等［29］的研究與上述結論類似.有報道顯示在LL-37作用下表達下調的PA基因中存在參與細菌黏附及與鞭毛生物合成有關的基因，這些基因的改變影響了PA的觸顫活動，從動力學上減少了生物膜的生成、發(fā)展［5］.

綜上，生物膜通過多種因素的協(xié)同作用引起致病菌的耐藥性顯著增加，是造成術后PJI難治、遷延不愈的重要因素之一，而LL-37亦通過多種機制發(fā)揮其對生物膜的抑制作用，是治療術后PJI的可行思路.但PJI 的治療多個環(huán)節(jié)，LL-37在其中的機制尚需更進一步明確；此外LL-37雖在體外模型中抗菌活性良好，但體內(nèi)模型的安全性乃至更進一步作為治療藥物應用仍需驗證.