綠豆中蛋白提取技術及活性物質的研究進展

柳芬芳，李迎秋

(齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 食品科學與工程學院)，濟南 250353)

綠豆，又稱青小豆，屬于菜豆豇豆屬中的一個種，是亞洲最重要的豆科植物之一。綠豆的生命周期短，是我國種植的食用豆類之一。在我國有著悠久的種植歷史且種植范圍較廣，主要集中在黃河、長江下游、華北等地區(qū)，其中以內蒙古、河南種植的面積較大。綠豆含有22%～26%的蛋白質，是一種非常重要的低成本、高營養(yǎng)食物，可以補充亞洲和非洲貧困人口的蛋白質缺乏[1]。綠豆也具有多種生物活性成分，如抗性淀粉、多糖、黃酮、抗真菌蛋白等，這些生物活性物質具有降血脂、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、提高免疫力等功效[2]，還具有健脾利尿、清熱解毒、活血化膿的保健功能。目前市場上的綠豆制品很多，如綠豆蛋白乳飲料、綠豆糕、綠豆粉皮等。此外，綠豆還可以發(fā)酵制成醬油。

綠豆蛋白除了營養(yǎng)屬性外，還具有功能特性，如持水性、溶解性、乳化性和起泡性等。蛋白質的這些功能特性在食品的生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用，在食品生產(chǎn)中的應用范圍也愈加廣泛。將綠豆蛋白應用于食品的生產(chǎn)制造中，可以改善食品的品質、營養(yǎng)價值和口感[3]，如：可以作為食品添加劑添加在糕點中，易于形成穩(wěn)定凝膠；可以添加在香腸中，改變其水分含量和質構特性；可以添加在速凍水餃中，改善其品質和儲藏性能?？剐缘矸劭梢蕴砑拥矫追?、粉皮等食品中提高它們的彈性和咀嚼性。綠豆中的抗真菌蛋白可以作為天然的防腐劑來提高食品的保質期。綠豆中超氧化物歧化酶可以添加在保健品中提高其抗氧化作用。綠豆中的黃酮類物質可以添加在香辛料中，提高香辛料中黃酮的含量，如芫荽能作為調味品主要是由于其富含揮發(fā)油、黃酮[4-5]。綠豆中活性物質雖然豐富，但還未完全得到開發(fā)和利用。

1 綠豆蛋白的提取

在提取綠豆蛋白之前，應浸泡去除雜質、烘干水分、粉碎，最后進行過篩處理。提取方法直接影響蛋白質的含量和多肽的質量，因此綠豆蛋白提取方法的選取極其重要，目前綠豆蛋白提取的方法主要有堿提酸沉法、熱水浸提法、超聲波協(xié)助提取法、酶法提取、超高壓輔助物理法等。

1.1 堿提酸沉法

堿提酸沉法是一種最常用的方法，根據(jù)堿提酸沉法的原理將綠豆處理成綠豆粉后，溶于一定量蒸餾水中，當pH處于堿性時，經(jīng)過離心后得到的上清液就是蛋白提取液。當提取液的pH值被酸調到4時，蛋白質處在等電狀態(tài)，絮狀物凝集下去，通過離心后獲得沉淀物，再經(jīng)冷凍干燥后即得綠豆分離蛋白。

喬寧[6]利用該方法來提取制備綠豆蛋白，通過優(yōu)化試驗得到最優(yōu)的工藝條件。在此前提下，對通過超聲波等多種方法輔助提取的綠豆分離蛋白進行了研究，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)的方式是超聲波輔助提取法。對綠豆蛋白的4種組分進行功能性研究，還探討了該分離蛋白添加在食品中的功能效果。

Du Mengxia 等[7]對提取條件進行了優(yōu)化，在料液比為1∶15.0 (mg/mL)、pH值為9.0、提取溫度為40 ℃的條件下，提取綠豆分離蛋白的效率最高，為73.25%。研究了綠豆蛋白的功能特性，對其氨基酸含量進行了分析，結果表明綠豆蛋白可作為潛在的營養(yǎng)保健品或功能性保健食品的成分。

1.2 熱水浸提法

熱水浸提法主要是為防止酸堿度過大影響其生物活性而提出的一種蛋白提取法，綠豆經(jīng)過除雜之后進行浸泡脫皮，把脫皮的綠豆浸泡一段時間后進行均質，然后進行離心去除淀粉，把上清液過濾掉，得到綠豆蛋白樣品。

考慮到堿提酸沉法的缺點，王維堅等[8]采用熱水浸提法提取綠豆蛋白，研究了單因素對提取的蛋白質含量的影響，找到了最佳的綠豆蛋白的分離浸提工藝：溫度40 ℃、浸提時間2 h、料液比1∶15 (g/mL)。在該基礎上，采用響應面法進一步得到最優(yōu)條件：溫度40 ℃、浸提時間2.3 h、料液比1∶15.3 (g/mL)，蛋白質提取量為813.24 μg/mL。

1.3 超聲波輔助法

超聲波是一種以振動為能量的新方法。超聲波可以促進破壁產(chǎn)生增溶作用而被廣泛應用來增加目標物質的提取率，它提取工藝流程簡單、成本較低、生產(chǎn)周期短，并且技術可靠，可用于食品工業(yè)的大規(guī)模生產(chǎn)[9]。其中報道中大豆、棉籽、玉米蛋白和麥子的蛋白提取都已采用超聲波輔助法，超聲提取綠豆分離蛋白的研究比較少見。

張玉霞等[10]將綠豆磨成粉后脫脂，將其作為原料，采取超聲波輔助法獲得了綠豆分離蛋白，通過優(yōu)化得出最適提取條件：超聲波輔助時間為25 min，浸提溫度為45 ℃，料液比為1∶12 (g/mL)，浸提pH值為8.5，蛋白質的提取率為95.1%。與單純堿提酸沉提取法相比，經(jīng)過超聲處理后提取時間縮短了，提取率提高了，效率也大大提高，成本降低。

楊勇等[11]研究了超聲波處理對綠豆分離蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)β-折疊結構含量降低，而β-轉角結構含量增加，還得知超聲波后綠豆蛋白的表面疏水性、乳化性、起泡性等功能特性都得到了增強。

1.4 酶法

酶法提取蛋白，發(fā)展時間短，但在營養(yǎng)和風味方面保持良好，應用日益廣泛。潘妍等[12]利用酶法提取了綠豆分離蛋白。先確定了效果最好的酶為堿性蛋白酶，通過單因素優(yōu)化條件得：加酶量7%、料液比1∶25、時間1 h。綠豆分離蛋白功效：對酪氨酸酶的抑制作用隨濃度的升高而增加，DPPH·和·OH的清除能力也隨著濃度升高而增加，證實了綠豆蛋白有美白和抗氧化的功能。

李積華等[13]研究了酶法水解綠豆蛋白的工藝，從氮收率和產(chǎn)物風味角度選取最佳酶種為Alcalase 2.4 L FG酶，運用響應面的方法進行提取條件的優(yōu)化，并研究了酶解后蛋白的動力學特性。

1.5 超高壓輔助法

超高壓技術(ultra high pressure processing，UHP)是一種新技術，以水或其他液體作為傳壓介質，對放置在密封的彈性容器內的食品進行100 MPa以上的高壓處理，具有很好的作用。近幾年來，超高壓技術作為一種非熱加工殺菌技術，應用在提取物質的一些有效成分中，與傳統(tǒng)制取方法相比，具有消耗能量少、耗時短、需要的溫度低等特點而備受關注[14]。國內外學者已先后開展了超高壓技術的研究，如在食品的貯藏保鮮和殺菌方面，果醬和果汁等產(chǎn)品的加工方面，改良食品的物性和酒類品質等方面的研究與應用，并且取得了很好的結果。

田海娟等[15]采用超高壓輔助法，通過蒸餾水的浸提得到綠豆蛋白提取液。經(jīng)過單因素、正交試驗優(yōu)化提取條件，研究了浸提壓力、加壓時間、料液比、浸提溫度對綠豆分離蛋白提取率的影響。得到最佳提取條件：加壓壓力300 MPa、加壓時間6 min、浸提溫度40 ℃、料液比1∶15 (g/mL)，綠豆活性蛋白的提取率可達79.2%。通過濾紙片法和打孔法研究了綠豆蛋白對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用。該法有綠色、環(huán)保、無污染、降低能耗和成本以及浸提時間短等優(yōu)點。

2 綠豆中的生物活性物質

2.1 多糖

多糖是構成人類生命活動四大基本物質之一，是一種具有生物活性的大分子物質，對維持生命體機能有重要的作用。其中，植物多糖能對免疫功能進行調節(jié)，有抗腫瘤、降血糖血脂等保健作用。近年來，開發(fā)多糖資源越來越受到關注[16]。余穩(wěn)穩(wěn)等[17]利用響應面優(yōu)化提取去皮后綠豆仁中可溶性多糖的最佳工藝條件，得到了最佳的實驗條件，在此條件下，多糖的提取率為4.32%，經(jīng)過Sevag法脫蛋白后，多糖純度達到了50.35%，其中蛋白質含量為31.26%。

鐘葵等[18]研究了一種堿法提取綠豆仁中多糖(AEMP)成分，對加堿液濃度、料液比、浸提溫度和浸提時間進行了優(yōu)化，得最佳工藝條件。在此條件下，得到多糖的提取率為9.70 mg GE/g DW。纖維離子色譜和凝膠色譜分離純化得到了兩種多糖組分，即AEMP-1和AEMP-2。AEMP及其分離純化組分AEMP-1和AEMP-2對羥自由基和DPPH自由基都有良好的清除效果，說明它們都具有較好的抗氧化活性。AEMP-2的抗氧化活性最強，對上述兩種自由基半數(shù)抑制濃度 IC50值分別為4.71 mg/mL和1.03×10-1mg/mL，對DPPH自由基的清除效果要比對清除羥自由基的效果好，是一種天然的抗氧化劑，具有一定的開發(fā)潛力。

Jiang Lian等[19]采用纖維素酶輔助提取法和熱水提取法分別從綠豆皮中提取和純化了MBP-1和MBP-2兩種水溶性多糖。熱重分析表明，MBP-2比MBP-1具有更穩(wěn)定的結構。相關的實驗表明，它們均對DPPH、OH和ABTS+自由基有清除能力，作用效果較強。MBP-1和MBP-2還對革蘭氏陽性(G+)和革蘭氏陰性(G-)菌表現(xiàn)出一定的抗菌活性。

2.2 黃酮類化合物

研究表明，綠豆皮和綠豆仁中都含有黃酮類化合物，這種活性物質具有抗氧化、降低血糖、增強免疫力等功效。吳小勇等[20]通過 L16(44)正交試驗，確定了溶劑回流提取法的工藝條件，在此前提下進一步對超聲波輔助溶劑法提取的工藝條件進行了優(yōu)化和效果比較。用FRAP法測定樣品的抗氧化能力，兩種不同的提取方法得到的產(chǎn)物的抗氧化能力差別不大。用DPPH法測定提取物的自由基清除能力，與VC相比，從綠豆種皮中提取的總黃酮的還原能力相當于VC的20%左右，自由基清除率與實驗條件下VC的差不多。

周俊鵬等[21]研究了綠豆皮中提取的黃酮的純化工藝，比較了4種大孔樹脂對其的吸附性和解吸性。研究得到AB-8型大孔樹脂的效果較好，并確定了最優(yōu)的吸附條件為:上樣的速度和質量濃度分別為1.98 mL/min和0.0459 mg/mL。同時得到解析液體積分數(shù)70%、洗脫速度1.98 mL/min為最優(yōu)解析條件。

2.3 苯丙氨酸解氨酶(PAL)

唐煦等[22]從綠豆中分離純化出了苯丙氨酸解氨酶，經(jīng)過凝膠電泳和等電聚焦電泳鑒定為一條均一區(qū)帶。綠豆中的PAL對小鼠淋巴細胞白血病細胞株體外抑制實驗，隨著酶劑量的增加和處理時間的延長，抑制作用也得到了增強。研究得出其對腫瘤細胞增殖的抑制作用與其降解腫瘤細胞生長所需要的苯丙氨酸有關。張瑜等[23]對明綠豆PAL通過硫酸銨分級和陰離子交換層析進行了分離純化，得到PAL的純化倍數(shù)為6.9829，蛋白質得率為4.65%，酶得率為32.45%。PAL適宜的pH范圍為7.6～9.0，適宜的溫度范圍為35～45 ℃，明綠豆PAL催化L-苯丙氨酸反應生成反式肉桂酸，剛開始發(fā)生反應的3 h內，反應產(chǎn)物與反應時間基本呈線性關系。到3 h之后，反應關系曲線逐漸變平緩，測量以PAL在3 h之內的活性為基準。

2.4 超氧化物歧化酶(SOD)

超氧化物歧化酶(SOD)存在于生命體中，避免由于超氧自由基的過多積累聚合而引起病癥或衰老的抗氧化金屬酶。它可以保護暴露在氧環(huán)境下的細胞，主要功能是經(jīng)過歧化反應催化超氧化物轉化為氧氣和過氧化氫。相微微等[24]研究了12個品種的綠豆中的SOD活性，首先對提取榆綠1號中SOD的工藝進行單因素試驗，采用正交試驗進行條件優(yōu)化，得到最優(yōu)條件：料液比為1∶20 (g/mL)，超聲波功率為140 W，pH為7.0的緩沖液，浸提溫度為60 ℃。在此條件下綠豆仁中SOD活性最高的品種是冀綠7號，而蘇拉2號的SOD活性最低，在品種不同的綠豆中SOD含量存在顯著差異。

符麗雪等[25]對綠豆發(fā)芽過程中SOD和蛋白質的變化規(guī)律進行研究，采用NBT光化還原法測定綠豆芽的SOD活性，并發(fā)現(xiàn)了SOD活力在發(fā)芽過程中的規(guī)律。在發(fā)芽3～7 d中，發(fā)芽初期到第5天時，SOD的比活力達到最大值783 U/mg，之后呈現(xiàn)下降趨勢。在綠豆生長過程中，不同的部位呈現(xiàn)不同的SOD比活力；其中根部SOD的比活力最強，為1649 U/mg。而蛋白質的含量變化比較單一，在發(fā)芽過程中持續(xù)上升。

2.5 胰蛋白酶抑制劑

胰蛋白酶抑制劑是一種抗營養(yǎng)因子，維持體內動態(tài)均衡，在生物的生理系統(tǒng)中發(fā)揮不可替代的作用。江均平等[26]研究了其在綠豆中的含量、多型性及穩(wěn)定性，明膠-PAGE活性染色結果表明：綠豆中含有M1～M44種胰蛋白酶抑制劑，其中M2為主要組分；綠豆胰蛋白酶抑制劑性質穩(wěn)定，經(jīng)過熱處理或酸處理后，M4消失，但產(chǎn)生了新的活性帶M5～M9。

樊艷平[27]對5個抗豆象綠豆品種的胰蛋白酶抑制劑的提取純化和穩(wěn)定性進行了研究，篩選出較強活性的胰蛋白酶抑制劑，并研究了蛋白酶抑制劑和抗蟲綠豆胰蛋白酶抑制劑對綠豆象幼蟲的殺菌機理以及其活性，從體內蛋白酶、代謝酶和保護酶活性以及生長發(fā)育的影響方面進行了研究。

2.6 抗性淀粉

抗性淀粉主要有預防和治療便秘、痔瘡、預防糖尿病、降血脂、預防脂肪肝、瘦身作用，同時會促進短鏈脂肪酸的形成，影響細菌的生長，促進維生素和礦物質的吸收。謝濤等[28]對綠豆進行了研究，通過制備和純化獲得了兩種抗性淀粉，并研究了它們的一些特性。研究發(fā)現(xiàn)：兩種抗性淀粉促進了雙歧桿菌和乳酸桿菌的增殖，且效果很好，達到100倍以上；抑制了大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的增殖，抑制強度好，達到了106倍；對糞腸球菌的抑制強度為10倍；而對梭狀桿菌沒有明顯影響。

郝征紅等[29]使用振動式超微粉碎技術處理使得綠豆抗性淀粉的得率提高，經(jīng)過單因素條件優(yōu)化確定微波糊化得到抗性淀粉最佳提取條件，為之后大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的理論條件。

2.7 抗真菌蛋白

吳金鴻[30]發(fā)現(xiàn)綠豆?jié){液經(jīng)過處理后，得到一個電泳純的抗菌活性組分 pm-ns LTP1(非特異性脂轉移蛋白)，經(jīng)SDS-PAEG得出這是一個含二硫鍵的單倍體蛋白。研究表明pm-ns LTP1對真菌菜豆根腐病菌、棉花枯萎病菌、瓜果腐霉病菌、水稻白絹病菌具有明顯的抑菌效果。

在綠豆中還發(fā)現(xiàn)一種抗真菌蛋白植物凝集素，Del等[31]研究發(fā)現(xiàn)，綠豆中有一種半乳糖四聚體結合蛋白，有兩種活性。結合蛋白結構隨著pH的變化從四聚體變?yōu)閱尉垠w。pH值為5.6時表現(xiàn)出半乳糖苷酶活性，是單聚體；pH值為7.0時表現(xiàn)出兩種活性，是一種四聚體。

2.8 其他活性物質

綠豆中還含有一些活性物質，如酸性磷酸酶，是一種單亞基酶；如幾丁質酶，是一種單倍體蛋白；如葡萄糖苷酶，綠豆中含有兩種β-葡萄糖苷酶，其中一種是雙亞基蛋白酶。除此以外，綠豆中還含有單寧、生物堿、皂甙等活性物質。

3 展望

綠豆是生活中常見的食用性豆科植物，蛋白含量豐富，價格低廉，有較好的開發(fā)前景。綠豆蛋白有良好的功能特性，在食品生產(chǎn)中的應用范圍也愈加廣泛。綠豆中的活性物質種類多、含量豐富，仍有其他活性物質待開發(fā)。將各種活性物質作為添加劑添加到食品中，可以改善它們的營養(yǎng)和口感。對研究出的活性物質進行相應的機理分析，以便進行相關食品的研發(fā)。目前，綠豆保健型食品雖然層出不窮，但國內外有關綠豆的活性成分綜合利用及相關產(chǎn)品研究開發(fā)的較少，造成了資源浪費等現(xiàn)象。