α-酮戊二酸的生物學(xué)功能及分子機(jī)制研究進(jìn)展

魏易焓，張 姹，束 剛

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣東省動物營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，廣東 廣州 510642）

骨骼肌在收縮過程中可以釋放多種肌肉因子（Myokines）和生物活性代謝中間產(chǎn)物（Myometabolites），通過自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌等方式調(diào)節(jié)動物機(jī)體活動。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，α-酮戊二酸（Alpha-Ketoglutaric Acid，AKG）是一種重要的肌肉代謝中間產(chǎn)物。在肌肉運(yùn)動過程中，三羧酸循環(huán)和谷氨酸脫氨基反應(yīng)均可以產(chǎn)生大量AKG。已有研究表明，AKG 在蛋白質(zhì)合成[1-2]、骨骼肌的發(fā)育和代謝[3-5]、鈣穩(wěn)態(tài)[6]等方面均發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。本文簡述AKG 的生理功能及其作用機(jī)制，為AKG 在畜禽生產(chǎn)和醫(yī)藥臨床應(yīng)用方面提供參考。

1 AKG 調(diào)節(jié)肌肉和骨骼發(fā)育

機(jī)體蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)是影響動物生長發(fā)育和肌肉肥大的重要因素[7]。骨骼肌蛋白質(zhì)的沉積主要取決于肌肉蛋白質(zhì)合成和降解的平衡[8-9]。有研究表明，在肌肉萎縮模型的DMD 小鼠中添加AKG，可以促進(jìn)蛋白質(zhì)沉積，緩解蛋白質(zhì)降解和肌肉萎縮癥狀[10]。有人醫(yī)臨床研究表明，將AKG 作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑可顯著促進(jìn)術(shù)后患者的肌肉蛋白合成[11]。AKG 促進(jìn)肌肉肥大的機(jī)制：一方面是通過激活A(yù)kt/mTOR 信號通路促進(jìn)骨骼肌蛋白合成[12-13]；另一方面，還可以通過抑制叉頭框O（Forkhead Box O，F(xiàn)oxO）家族蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而降低MuRF1和MAFbx基因的表達(dá)，抑制蛋白質(zhì)降解。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，AKG 對肌肉蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)的調(diào)控作用可能與脯氨酸羥化酶（Proline Hydroxylase，PHDs）有關(guān)。PHDs 是在低氧條件下表達(dá)的重要羥基化酶[14]，該酶可以通過羥基化靶蛋白，進(jìn)而引起靶蛋白的泛素化和降解。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，AKG 可以抑制PHD3 活性，維持骨骼肌中腎上腺素能受體β2 受體（Adrenergic Receptor，ADRB2）蛋白的穩(wěn)定性，從而抑制蛋白質(zhì)降解，防止肌肉萎縮[10]。

此外，骨骼肌分泌的AKG 還可以旁分泌的形式調(diào)控骨骼的發(fā)育和骨鈣代謝。Andersen 等[15]研究表明，在仔豬日糧中添加AKG 3 周可明顯提高仔豬的骨長度、皮質(zhì)骨密度、最大彈性強(qiáng)度和極限強(qiáng)度。Tatara 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，切除火雞直腸神經(jīng)會引起骨半徑減少，而添加AKG 后能有效增加火雞的體積骨密度、橫截面積、平均相對壁厚、最大彈性強(qiáng)度和極限強(qiáng)度。也有研究表明，在羊羔日糧中添加AKG 2 周可顯著增加骨質(zhì)密度和骨最大彈性強(qiáng)度[17-18]。此外，有臨床研究還發(fā)現(xiàn)，添加AKG 對人的骨組織有類似影響[19-20]。最近的一項研究表明[21]，腸內(nèi)AKG 含量與雌激素水平升高有關(guān)，AKG對絕經(jīng)后婦女在保持骨量和預(yù)防骨鈣流失方面具有潛在的作用。已有研究表明，在成骨細(xì)胞[22]和破骨細(xì)胞[23]上有谷氨酸受體（Glutamate Receptor，GluR），AKG可通過谷氨酸與GluR 間的互作影響骨骼發(fā)育[24]。其次，AKG 可以促進(jìn)膠原蛋白的合成，進(jìn)而調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育。AKG 可以通過脯氨酸參與膠原蛋白合成。脯氨酸作為膠原蛋白的主要成分，在膠原代謝中起著重要作用。研究表明，膠原蛋白中脯氨酸的羥基化在膠原蛋白螺旋結(jié)構(gòu)的形成中至關(guān)重要[25-26]。AKG 是脯氨酸-4-羥化酶（Prolyl 4 Hydroxylase，P4H）的輔助因子，可以促進(jìn)4-羥基脯氨酸的形成[27]。最近的一項研究表明[28]，AKG 可以誘導(dǎo)JNK、mTOR、S6K1 和S6 的磷酸化，激活JNK 和mTOR/S6K1/S6 信號通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。其中，JNK 信號通路[29-30]和mTOR 信號通路[31-32]均已被證實參與成骨細(xì)胞分化過程，mTOR 信號通路可以激活底物S6K1，促進(jìn)細(xì)胞分化所需的蛋白質(zhì)的合成[33]。

2 AKG 在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝方面的作用

AKG 是三羧酸循環(huán)的重要代謝中間產(chǎn)物。骨骼肌在收縮過程中釋放的AKG 對細(xì)胞代謝具有重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，從而可以延緩細(xì)胞壽命，調(diào)節(jié)糖脂代謝和腫瘤細(xì)胞代謝中發(fā)揮重要的作用。

AKG 可以調(diào)節(jié)微生物和動物的代謝水平，具有延長細(xì)胞壽命的潛力。Chin 等[34]研究發(fā)現(xiàn)，AKG 可以改善成年秀麗隱桿線蟲因衰老引起的運(yùn)動機(jī)能協(xié)調(diào)障礙，表明AKG 延長線蟲壽命的機(jī)制主要與其抑制ATP 合成酶有關(guān)。線粒體ATP 合成酶是幾乎所有活細(xì)胞能量代謝必須的關(guān)鍵酶[35-36]。研究表明，ATP 合成酶的β亞基（ATP-2）是一種新型的AKG 的結(jié)合蛋白，AKG 可以通過直接結(jié)合ATP-2，抑制相關(guān)的酶，使ATP 水平和耗氧量降低，從而延長成年秀麗隱桿線蟲的壽命。Su 等[37]研究表明，AKG 可使果蠅的平均細(xì)胞壽命延長8%，最高延長15%，這一過程主要通過激活A(yù)MP 活化蛋白激酶（AMP Activated Protein Kinase，AMPK）信號和抑制雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）通路達(dá)到延長果蠅細(xì)胞壽命的效果。一方面，AKG 可以刺激蛋白激酶A（Protein Kinase A，PKA）的表達(dá)，進(jìn)而通過增強(qiáng)LKB1基因的表達(dá)激活A(yù)MPK。另一方面，AKG 可以抑制mTOR 通路相關(guān)基因（如TORC、PI3K）的表達(dá)，同時增加與自噬過程相關(guān)的基因（如TEEB、Atg）的表達(dá)，從而達(dá)到抑制蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞增殖，增加自噬的作用。

AKG 可以通過多種途徑調(diào)節(jié)糖脂代謝，改善胰島素敏感性、促進(jìn)脂肪組織燃燒和分解，從而在預(yù)防肥胖和糖尿病等代謝性疾病中起積極作用。Tekwe 等[38]研究表明，AKG 可以通過抑制磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶（GFAT）催化合成葡萄糖-6-磷酸的過程以及誘導(dǎo)降低血漿中亮氨酸濃度的途徑，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial Cells，EC）合成一氧化氮（Nitric Oxide，NO），從而改善胰島素的敏感性，緩解機(jī)體心血管功能障礙。此外，AKG 還可通過表觀遺傳和內(nèi)分泌機(jī)制促進(jìn)脂肪代謝。Yang 等[39]研究表明，褐色脂肪中的AKG 可以與Tet蛋白酶結(jié)合，促進(jìn)Prdm16 啟動子發(fā)生DNA 去甲基化，同時激活A(yù)MPK，共同促進(jìn)脂肪褐色化。Yuan 等[40]的最新研究也發(fā)現(xiàn)，AKG 可以通過膜受體OXGR1 的介導(dǎo)刺激腎上腺素的釋放，進(jìn)而增加褐色脂肪代謝和白色脂肪的脂解。

此外，AKG 還可以抑制腫瘤細(xì)胞代謝和惡性發(fā)展。Morris 等[41]研究發(fā)現(xiàn)，AKG 介導(dǎo)了抑癌基因p53對腫瘤細(xì)胞惡性發(fā)展的抑制作用；對于p53 缺陷型腫瘤細(xì)胞，AKG 的積累還可以重新調(diào)整腫瘤細(xì)胞的代謝，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化并抵抗惡性腫瘤細(xì)胞增殖，結(jié)果表明p53基因的失活一定會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)變，當(dāng)恢復(fù)p53 缺陷型腫瘤細(xì)胞中的p53基因活性時，AKG/琥珀酸的比值增加，AKG 的積累使AKG 依賴性染色質(zhì)修飾5′-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）水平增加，促進(jìn)DNA 去甲基化，實現(xiàn)p53 引發(fā)腫瘤細(xì)胞的分化。反之，用AKG依賴性雙加氧酶競爭性抑制劑使AKG/ 琥珀酸的比值降低，則會減弱p53 抑制腫瘤細(xì)胞癌變的能力。

3 AKG 在調(diào)節(jié)免疫和炎癥方面的作用

T 淋巴細(xì)胞亞群是動物機(jī)體細(xì)胞免疫的重要組成部分。原始T 細(xì)胞可以分化成不同亞群，其中效應(yīng)T細(xì)胞（Effector T Cells，Te）具有釋放淋巴因子的功能；調(diào)節(jié)性/ 抑制性T 細(xì)胞（Regulatory/suppressor T Cells，Tr）具有抑制細(xì)胞免疫及體液免疫的功能[42-44]；輔助性T 細(xì)胞（Helper T Cells，Th）具有協(xié)助體液免疫和細(xì)胞免疫的功能。有研究表明，AKG 在T 細(xì)胞的分化去路中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[45-51]。Klysz 等[45]研究表明，在去除谷氨酰胺的小鼠中添加可滲透入細(xì)胞的AKG 衍生物——α-酮戊二酸二甲酯（Dimethyl AKG，DMK），在細(xì)胞中出現(xiàn)了大量的Tbet 轉(zhuǎn)錄因子，而Foxp3 陽性細(xì)胞的生成減少。其中，Tbet 是生成Th1亞群細(xì)胞所需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)oxp3 陽性細(xì)胞可形成大量Tr 亞群，發(fā)揮抑制免疫的功能。此外，原始T 細(xì)胞向Th1 的分化依賴于mTOR 信號通路[46-47]，若抑制mTOR 活性，則會促進(jìn)原始T 細(xì)胞分化為Tr 細(xì)胞亞群，反之亦然[48-50]。研究發(fā)現(xiàn)，T 細(xì)胞內(nèi)AKG 的增加提高了mTOR 信號，促進(jìn)初始T 細(xì)胞向Th 轉(zhuǎn)化，促進(jìn)免疫機(jī)能的發(fā)揮[51]。此外，AKG 可以調(diào)節(jié)T 細(xì)胞分化的機(jī)制還與表觀遺傳學(xué)修飾狀態(tài)有關(guān)。AKG 依賴的蛋白酶Tet2 可與AKG 共同作用，催化5-甲基胞嘧啶（5-mC）轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC），后者可以促進(jìn)DNA 去甲基化，促進(jìn)原始T 細(xì)胞分化成熟。若Tet2缺乏，會抑制原始T 細(xì)胞分化為Th1，使免疫機(jī)能降低。

除T 細(xì)胞外，巨噬細(xì)胞總量的增加和M1/M2 巨噬細(xì)胞比例通常也是組織發(fā)生炎癥的重要標(biāo)志。已有研究表明，三羧酸循環(huán)及其內(nèi)源性代謝物在調(diào)節(jié)脂肪組織的炎癥中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[52]。Liu 等[53]研究表明，在飼喂高脂日糧的小鼠模型中添加褪黑素，可以提高脂肪細(xì)胞線粒體中的異檸檬酸脫氫酶2（Isocitrate Dehydrogenase 2，IDH2）的水平，促進(jìn)AKG 水平增加。AKG 可以外泌體的形式轉(zhuǎn)運(yùn)到巨噬細(xì)胞，與Tet 蛋白酶結(jié)合共同介導(dǎo)DNA 去甲基化，降低了M1/M2 巨噬細(xì)胞的比例，緩解脂肪細(xì)胞炎癥。此外，多數(shù)炎癥通路都可以激活NF-κB 信號通路以增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。外泌體AKG 還可以通過oxoglutarate 受體1（OXGR1）減弱脂肪細(xì)胞中STAT3/NF-κB 信號，進(jìn)而緩解脂肪炎癥[54]。該研究為外泌體途徑運(yùn)輸代謝物，用以治療與肥胖相關(guān)的代謝性疾病提供新的策略。

4 AKG 在干細(xì)胞發(fā)育中的作用

干細(xì)胞是來自于胚胎、胎兒或成體內(nèi)可以在一定條件下進(jìn)行無限次自我更新與增殖分化的一類細(xì)胞，在治療疾病和修復(fù)創(chuàng)傷中具有廣泛的應(yīng)用前景。已有研究表明[55-58]，AKG 在促進(jìn)胚胎干細(xì)胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）和成體干細(xì)胞的增殖與分化中發(fā)揮著重要作用。胚胎干細(xì)胞可以分為原始態(tài)多能干細(xì)胞和始發(fā)態(tài)多能干細(xì)胞，雖然原始態(tài)和始發(fā)態(tài)多能干細(xì)胞都具有分化成其他成體細(xì)胞的能力，但原始態(tài)多能干細(xì)胞在發(fā)育鏈上位于更早期的位置，分化的靈活性強(qiáng)，分化為特定細(xì)胞和組織的偏向性小，在再生醫(yī)學(xué)方面具有更高的應(yīng)用價值。Carey 等[55]研究表明，在沒有添加外源谷氨酰胺的條件下，模擬內(nèi)細(xì)胞團(tuán)外胚層細(xì)胞表型的無血清培養(yǎng)基中的小鼠ESCs 與傳統(tǒng)血清培養(yǎng)基中的小鼠ESCs相比，仍然可以大量增殖，保持ESC 形態(tài)和多能性的特征，產(chǎn)生大量AKG，并且小鼠ESCs 通過調(diào)節(jié)自身的代謝，抑制AKG 生成琥珀酸鹽，促進(jìn)AKG 與Tet 蛋白酶結(jié)合，共同作用催化5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）的生成，誘導(dǎo)DNA 去甲基化，進(jìn)而激活與保持干細(xì)胞多能性有關(guān)的基因表達(dá)，促進(jìn)原始態(tài)多能干細(xì)胞的增殖，而抑制分化，使小鼠ESCs 保持多能性；此外，向傳統(tǒng)血清培養(yǎng)基中添加AKG 可以使傳統(tǒng)血清培養(yǎng)基中的小鼠ESC 變得更接近無血清培養(yǎng)基中的小鼠ESCs[55]。與小鼠ESCs 不同，人類的胚胎干細(xì)胞屬于始發(fā)態(tài)多能干細(xì)胞。TeSlaa 等[56]研究表明，在始發(fā)態(tài)人類多能干細(xì)胞（human Pluripotent Stem Cells，hPSCs） 中增加AKG 或AKG/ 琥珀酸的比例可以誘導(dǎo)組蛋白與DNA發(fā)生去甲基化，促進(jìn)始發(fā)態(tài)多能干細(xì)胞的分化。以上研究表明，AKG 既可以增強(qiáng)與保持DNA 和組蛋白低水平甲基化有關(guān)的酶活性，從而維持原始態(tài)多能干細(xì)胞的自我更新狀態(tài)，同時還可以促進(jìn)表觀基因組重構(gòu)，誘導(dǎo)始發(fā)態(tài)多能干細(xì)胞分化。

成體干細(xì)胞存在于機(jī)體的各種組織器官中，多處于休眠狀態(tài)。在特定條件下，成體干細(xì)胞能夠進(jìn)行自我更新，并分化成該類型組織的細(xì)胞。Song 等[57]研究表明，在胰腺干細(xì)胞中添加AKG，可以增強(qiáng)干細(xì)胞有關(guān)基因的表達(dá)，上調(diào)干細(xì)胞增殖標(biāo)記物，促進(jìn)胰腺干細(xì)胞的增殖；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在添加AKG 的胰腺干細(xì)胞中，Tet 蛋白酶的表達(dá)量上升，5-甲基胞嘧啶（5-mC）的表達(dá)量下降，與干細(xì)胞增殖相關(guān)的基因CyclinD1發(fā)生去甲基化，表明AKG 促進(jìn)胰腺干細(xì)胞增殖的機(jī)制是通過與Tet 蛋白酶共同作用誘導(dǎo)DNA 去甲基化實現(xiàn)的。同理，Tischler 等[58]研究也表明，在原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞（Primordial Germ Cells-Like Cells，PGCLCs） 中添加AKG，Tet1 的表達(dá)量顯著上升，組蛋白去甲基化酶的活性也提高，從而促進(jìn)PGCLCs 分化為精子和卵子。Yang 等[59]研究表明，敲除Tet1 和Tet2 蛋白酶會阻斷DNA 的去甲基化，進(jìn)而導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMMSCs）的自我更新和分化能力受損，破壞骨髓穩(wěn)態(tài)，敲除Tet1 和Tet2蛋白酶還降低了BMMSCs 中5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）的水平，這與AKG 與Tet 蛋白酶共同促進(jìn)DNA 去甲基化的過程表現(xiàn)相似。上述結(jié)果均提示，AKG 可能促進(jìn)BMMSCs 的更新與分化，從而維持BMMSCs 的功能。

5 展 望

綜上，AKG 可以通過復(fù)雜的信號通路調(diào)節(jié)肌肉和骨骼發(fā)育、細(xì)胞代謝、免疫炎癥和干細(xì)胞發(fā)育等生理過程，這些進(jìn)展對于畜牧生產(chǎn)和人類臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用AKG 具有重要的借鑒價值。雖然對AKG 的營養(yǎng)生理學(xué)功能研究已經(jīng)取得了重大突破，但何種運(yùn)動方式產(chǎn)生的AKG 水平更高，AKG 在細(xì)胞外、細(xì)胞漿和線粒體內(nèi)的感應(yīng)機(jī)制是否相同等諸多問題尚未解決，均有待于進(jìn)一步深入研究。