青稞種子萌動(dòng)過程中抗氧化活性的變化

白永亮，凌志洲，陳甜妹，曾 榮，夏 雨，吳俏槿 ，劉靄莎

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528000；2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641；3.咀香園健康食品（中山）有限公司，廣東 中山 528437）

【研究意義】青稞（Hordeum vulgareL.var.nudum hook.f.）是禾本科大麥屬的一種禾谷類作物，富含β-葡聚糖、多酚類化合物、黃酮和γ-氨基丁酸（GABA）等重要生物活性成分[1]，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗糖尿病等重大生理作用[2-5]，且萌動(dòng)后的青稞抗氧化活性及抑癌防癌作用均明顯高于未經(jīng)萌動(dòng)處理的青稞[6-7]。此外，青稞還含有能清除體內(nèi)自由基、延緩衰老的超氧化物歧化酶（SOD）[8]，有激活腦內(nèi)葡萄糖代謝、促進(jìn)乙酰膽堿合成、降血氮、降血壓等生理功能[9-11]。目前青稞的應(yīng)用仍然停留在較基礎(chǔ)的層次上，如青稞粉、青稞面和青稞烘焙等產(chǎn)品，對(duì)于青稞的深加工利用和經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了一定的局限性[12]。

【前人研究進(jìn)展】楊希娟等[13]研究發(fā)現(xiàn)青稞酚類化合物含量與粒色有關(guān)，黑色粒色酚類化合物含量最高，且自由基清除能力的強(qiáng)弱與酚類物質(zhì)的形態(tài)結(jié)構(gòu)相關(guān)；張帥等[14]研究了不同粒色青稞營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)與抗氧化活性的差異，結(jié)果表明彩色青稞的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和抗氧化活性物質(zhì)含量均優(yōu)于白色青稞，證明抗氧化活性與青稞的粒色相關(guān)；邢玉曉[15]研究了不同品種青稞的抗氧化活性及其作用，表明青稞的抗氧化活性非單一，而是多種有效物質(zhì)綜合發(fā)揮作用的結(jié)果。青稞抗氧化成分的研究主要集中在多糖、酚類、花青素、紫色素等方面[16-19]，而有關(guān)青稞經(jīng)萌動(dòng)處理后抗氧化活性的研究較少?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，通過萌動(dòng)改善青稞食用品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值成為研究熱點(diǎn)[20-22]。谷物萌動(dòng)后蛋白酶等水解酶系活性被激活，導(dǎo)致α-淀粉酶、纖維素酶、植酸酶、β-葡聚糖酶等酶活力提高，促進(jìn)了谷物中營(yíng)養(yǎng)和功能性組分含量的改變[23]。谷物在萌動(dòng)過程中胚乳細(xì)胞壁破裂導(dǎo)致胚乳內(nèi)儲(chǔ)存的物質(zhì)降解，為胚軸生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)和供能，這種變化一定程度上降解和消除了抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)，并增加了對(duì)人體有益的物質(zhì)如GABA和生育酚等，同時(shí)使得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更有利于人體吸收[24]。目前關(guān)于青稞萌動(dòng)后在抗氧化活性方面的研究較少，主要集中在品種間青稞酚類化合物種類、含量及抗氧化活性差異等方面?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于青稞的抗氧化活性，研究青稞浸麥和萌芽過程中總酚、黃酮、GABA和β-葡聚糖含量的變化規(guī)律，探究其與抗氧化活性的相關(guān)性，為青稞功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

青稞（藏青2000）產(chǎn)于西藏林芝地區(qū)工布江達(dá)縣巴河鎮(zhèn)甲熱村，干麥芽、干谷芽、干稻芽購于安徽毫州。

GABA標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC≥99%，購于上海金穗生物科技有限公司；2,4-二硝基氟苯（FDNB），純度≥98%，購于上海麥克林科技有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，購于上海源葉生物科技有限公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、FoLin酚試劑等，均為分析純，購于廣東光華科技股份有限公司。

1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀，購于安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；LHS-150/250HC-Ⅱ恒溫恒濕培養(yǎng)箱，購于上海一恒科學(xué)儀器有限公司；752紫外可見分光光度計(jì)，購于上海現(xiàn)科分光儀器有限公司；Dura pro 12超純水系統(tǒng)，購于澤拉布儀器科技（上海）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

將青稞種子用0.85 mm篩網(wǎng)篩選，去除雜物和石子，挑選生理狀態(tài)良好、沒有破損、顆粒飽滿的青稞籽粒，用清水反復(fù)沖洗干凈，再用2%的次氯酸鈉在室溫下浸泡15 min后用無菌水洗滌4～5次。（1）浸麥時(shí)間的影響：將處理好的青稞在15℃下按照浸4斷2方式（浸麥4 h-空氣休止2 h，蒸餾水）設(shè)5個(gè)萌動(dòng)處理，分別浸麥0、6、12、18、24 h，然后在25 ℃、濕度90%、光照強(qiáng)度7 500 lx下萌動(dòng)48 h。（2）萌芽時(shí)間的影響：將處理好的青稞在15 ℃下按照浸4斷2方式浸麥處理24 h后，在25 ℃、濕度90%、光照強(qiáng)度7 500 lx下，設(shè) 7個(gè)處理分別萌動(dòng)0、8、16、24、32、40、48 h。萌動(dòng)后將青稞芽經(jīng)真空冷凍干燥，分別測(cè)定浸麥、萌芽過程中4種功能性成分含量的變化，重復(fù)3次。

將青稞芽（15 ℃浸麥24 h，25 ℃、濕度90%、光照強(qiáng)度7 500 lx下萌芽48 h制備）、麥芽、谷芽和稻芽經(jīng)真空冷凍干燥，然后粉碎過0.180 mm篩，以料液比1∶10、50 ℃蒸餾水稀釋，攪拌均勻，超聲波提取10 min，再經(jīng)50 ℃水浴鍋中提取5 min，6 000 r/min離心10 min，取上清液備用。按照0.025、0.033、0.050、0.010 mg/L濃度梯度分別配制4種芽提取液，待測(cè)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 GABA 采用高效液相色譜法測(cè)定，結(jié)合段智紅等[25]的方法稍作改動(dòng)。衍生劑為1% 2,4-二硝基氟苯（FDNB）乙腈溶液；流動(dòng)相由A、B雙組分組成，A流動(dòng)相為pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，B流動(dòng)相為V（CH3CN）∶V（H2O）=1∶1；柱溫35 ℃，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，梯度洗脫方法見表1。所得標(biāo)曲為Y=211.29X-0.3446（R2=0.9992）。

表1 GABA流動(dòng)相洗脫梯度Table 1 GABA mobile phase elution gradient

1.3.2 總酚含量 采用Folin-Ciocalteu法[26]測(cè)定。

1.3.3 黃酮含量 采用硝酸鋁顯色法[27]測(cè)定。

1.3.4 β-葡聚糖含量 采用剛果紅法[28]測(cè)定。

1.3.5 羥自由基清除率 參考杜道坤等[29]的方法稍作改進(jìn)。于試管中加入樣品0.5 mL、9.1 mmol/L水楊酸乙醇溶液0.5 mL、9 mmol/L FeSO4溶液0.5 mL，最后再加入8.8 mmol/L H2O25 mL啟動(dòng)反應(yīng)；37 ℃水浴反應(yīng)0.5 h，以蒸餾水作對(duì)照，在510 nm處測(cè)吸光度，重復(fù)3次。計(jì)算清除率：

式中，D0（510nm）為空白管吸光度，D1（510nm）為反應(yīng)溶液吸光度，D2（510nm）為只含H2O2和樣品液對(duì)照管的吸光度。

1.3.6 金屬離子還原能力測(cè)定 參考袁博等[30]的方法稍作改進(jìn)。在試管中依次加入pH 6.6磷酸緩沖液2.5 mL、待測(cè)樣品1 mL、1%鐵氰化鉀溶液1 mL，混勻，于50 ℃恒溫條件反應(yīng)20 min，冷卻；加入10%三氯乙酸2.5 mL反應(yīng)0.5 h，4 000 r/min離心10 min。取上清液5 mL，加入水5 mL、0.1%三氯化鐵溶液1 mL，混勻靜置10 min。以蒸餾水作對(duì)照于700 nm下測(cè)定吸光度，重復(fù)3次。吸光度越大，表明樣品還原力越強(qiáng)。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 2017SP2和Microsoft Excel 2016進(jìn)行整理和作圖，采用SPSS19.0進(jìn)行方差分析和多重比較，相關(guān)性分析使用Pearson雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞浸麥過程中活性成分和抗氧化活性的變化

圖1 浸麥時(shí)間對(duì)青稞黃酮及總酚含量的影響Fig.1 Effect of soaking time on the contents of flavonoids and total phenols in highland barley

圖2 浸麥時(shí)間對(duì)青稞GABA及β-葡聚糖含量的影響Fig.2 Effect of soaking time on the contents of GABA and β-Glucan in highland barley

圖3 浸麥時(shí)間對(duì)青稞羥自由基清除率和金屬離子還原能力的影響Fig.3 Effects of soaking time on the hydroxyl free radical clearance rate and reduction capacity of metal ions of highland barley

由圖1、圖2可知，在本試驗(yàn)條件下，青稞經(jīng)浸麥萌動(dòng)后總酚和黃酮含量隨著浸麥時(shí)間的延長(zhǎng)不斷提高，以黃酮含量增長(zhǎng)速率較快；GABA含量隨著浸麥時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后平穩(wěn)的趨勢(shì)；β-葡聚糖含量隨浸麥時(shí)間延長(zhǎng)則緩慢下降。由圖3可知，青稞經(jīng)浸麥萌動(dòng)處理后對(duì)羥自由基的清除率在浸麥6 h達(dá)到最大值（64.88%），在浸麥18 h逐漸趨于穩(wěn)定；青稞對(duì)金屬離子還原能力在浸麥6 h達(dá)到最大（0.91），之后開始出現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)。

2.2 青稞萌芽過程中活性成分和抗氧化活性的變化

圖4 萌芽時(shí)間對(duì)青稞黃酮及總酚含量的影響Fig.4 Effect of germination time on the contents of flavonoids and total phenols in highland barley

圖5 萌芽時(shí)間對(duì)青稞GABA及β-葡聚糖含量的影響Fig.5 Effect of germination time on the contents of GABA and β-Glucan in highland barley

圖6 萌芽時(shí)間對(duì)青稞羥自由基清除率和金屬離子還原能力的影響Fig.6 Effects of germination time on the hydroxyl free radical clearance rate and reduction capacity of metal ions of highland barley

由圖4可知，青稞萌動(dòng)后總酚和黃酮含量均隨萌芽時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。與浸麥萌動(dòng)相比，總酚和黃酮含量在萌芽初始階段上升速率較快，總酚含量在萌芽40 h達(dá)到最高為2.584 mg/g，黃酮含量在萌芽32 h達(dá)到最大為2.306 mg/g。由圖5可知，與浸麥階段相比，GABA含量在萌芽過程中上升速率顯著提高，β-葡聚糖含量進(jìn)一步下降。由圖6可知，隨著萌芽時(shí)間的延長(zhǎng)，萌動(dòng)青稞對(duì)羥自由基的清除率和金屬離子還原能力均呈先升高后降低的趨勢(shì)，其中羥自由基的清除率在萌芽8 h達(dá)到最高值71.23%，對(duì)金屬離子還原能力也在萌芽8 h達(dá)到最大值。

2.3 功能性成分與抗氧化活性的相關(guān)性分析

由表2的相關(guān)性分析可知，與萌芽階段相比，總酚在浸麥階段與抗氧化活性相關(guān)性較強(qiáng)，但不顯著。原因可能是由于青稞體外抗氧化活性與總酚含量相關(guān)，但同時(shí)也存在其他成分對(duì)抗氧化活性的貢獻(xiàn)，且各功能性成分之間可能存在相互影響。本研究結(jié)果表明，青稞浸麥和萌芽過程中黃酮含量與抗氧化活性均無顯著相關(guān)性，但萌芽階段的相關(guān)性比浸麥階段高，這可能受到其他未測(cè)定的抗氧化成分的影響，也可能與物質(zhì)之間的協(xié)同作用機(jī)制有關(guān)。與萌芽階段相比，GABA在浸麥階段與抗氧化活性的相關(guān)性較高，且顯著相關(guān)，說明浸麥時(shí)間對(duì)提高青稞抗氧化活性具有顯著影響。β-葡聚糖在浸麥及萌芽過程中均呈負(fù)相關(guān)，但不顯著。

表2 青稞功能性成分與抗氧化活性的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of functional components and antioxidant activity of highland barley

2.4 青稞芽、麥芽、谷芽和稻芽之間的抗氧化活性比較

由圖7、圖8可知，4種谷物芽的抗氧化活性隨著樣品濃度的升高而增強(qiáng)，在一定濃度范圍內(nèi)，麥芽對(duì)羥自由基清除率最強(qiáng)，其次是青稞芽和谷芽，稻芽最差；各谷物芽對(duì)金屬離子還原能力強(qiáng)弱表現(xiàn)為麥芽＞稻芽＞谷芽＞青稞芽。不同谷物芽在羥自由基清除能力和金屬離子還原能力上體現(xiàn)出不同的結(jié)果，可能與谷物中所含黃酮、酚類等物質(zhì)的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及含量差別有關(guān)。不同形態(tài)酚類及黃酮類物質(zhì)對(duì)清除自由基及金屬離子還原能力的強(qiáng)弱具有選擇性，青稞芽的抗氧化活性受游離態(tài)及結(jié)合態(tài)酚類等化合物含量的共同影響[13,31]。

圖7 4種谷物芽粉對(duì)羥自由基清除率的影響Fig.7 Effects of four kinds of cereal bud powders on hydroxyl free radical clearance rate

圖8 4種谷物芽粉對(duì)金屬離子還原能力的影響Fig.8 Effects of four kinds of cereal bud powder on reduction capacity of metal ions

3 討論

種子萌動(dòng)改性是一種有效改善谷物食用品質(zhì)和提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的方法[6-7]，通過萌動(dòng)處理可以提高青稞功能性成分的含量及增加其抗氧化活性。青稞浸麥萌動(dòng)后抗氧化活性得到提高，可能與籽粒吸水膨脹后各種內(nèi)源酶被激活導(dǎo)致酚類及黃酮類物質(zhì)含量上升有關(guān)，與本研究結(jié)果青稞浸麥萌動(dòng)后酚類、黃酮及GABA含量增加一致。浸麥時(shí)間超過6 h，萌動(dòng)青稞抗氧化活性開始降低，可能與β-葡聚糖等成分的降解有關(guān)，青稞籽粒隨浸麥時(shí)間延長(zhǎng)膨脹度升高，β-葡聚糖酶活性進(jìn)一步增強(qiáng)，促使β-葡聚糖迅速降解[32]；同時(shí)，與多酚氧化酶的活性處于較高水平有關(guān)，部分多酚被氧化分解也可能導(dǎo)致青稞抗氧化活性下降。綜上，浸麥萌動(dòng)處理可以提高青稞的抗氧化活性，可通過選擇適宜的浸麥時(shí)間獲得高抗氧化活性青稞芽。

青稞處于萌芽萌動(dòng)初期，各種酶活不斷提高、生化反應(yīng)激烈，總酚、黃酮和GABA含量隨著萌芽時(shí)間延長(zhǎng)而增加。總酚、黃酮和GABA功能性成分在萌芽前期均存在迅速積累的過程，導(dǎo)致羥自由基清除率不斷上升，其后保持較高的穩(wěn)定水平[24]。同時(shí)，隨著萌芽時(shí)間的延長(zhǎng)，青稞芽?jī)?nèi)的能量和物質(zhì)被不斷消耗，導(dǎo)致抗氧化活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[23]，因此要合理調(diào)控青稞萌芽時(shí)間，以獲得高抗氧性青稞原料。

研究表明，酚類物質(zhì)分子因具有強(qiáng)螯合性，能較好地清除人體內(nèi)的自由基，起到抗氧化、抗衰老的效果[33]。黃酮是一種強(qiáng)抗氧劑，可有效清除體內(nèi)自由基，具有抗衰老、防癌抑癌、保護(hù)心血管、抗心律失常等作用[34]。但本研究結(jié)果表明，青稞浸麥及萌芽過程中抗氧化活性與總酚、黃酮含量相關(guān)性均不顯著，與韓玲玉等[35]的研究結(jié)果相似。原因一方面由于其他活性成分對(duì)抗氧化活性的貢獻(xiàn)及存在相互影響，還可能與青稞在不同萌動(dòng)階段黃酮和多酚的存在形態(tài)、組成以及含量差異有關(guān)[36]。目前對(duì)于GABA的研究主要集中在GABA的富集及生理功能研究方面[37]，未見涉及探討GABA與抗氧化的相關(guān)性研究。本試驗(yàn)結(jié)果表明，GABA在青稞浸麥萌動(dòng)中與抗氧化活性顯著相關(guān)，可通過調(diào)控浸麥工藝來提高青稞原料的抗氧化活性，其相關(guān)影響原理目前尚無定論，仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

青稞種子經(jīng)萌動(dòng)處理后可增強(qiáng)抗氧化活性和增加功能性成分含量，總酚、黃酮及GABA在萌動(dòng)處理后含量均得到提高；抗氧化活性最強(qiáng)的浸麥時(shí)間為浸麥萌動(dòng)6 h，最強(qiáng)的萌芽時(shí)間為萌芽萌動(dòng)8 h。本試驗(yàn)結(jié)果表明，萌動(dòng)處理可作為一種有效提高青稞抗氧化活性的方法。

相關(guān)性分析表明，不同功能性成分在不同萌動(dòng)階段與抗氧化活性呈現(xiàn)不同的相關(guān)性P值。在4種成分中，黃酮在萌芽階段呈現(xiàn)較高的相關(guān)性，GABA與浸麥階段抗氧化活性顯著相關(guān)。為了更好地評(píng)估青稞的抗氧化活性，需進(jìn)一步采用不同機(jī)理的抗氧化評(píng)價(jià)方法，從不同側(cè)面來反映青稞抗氧化活性的水平。

此外，各谷物芽的抗氧化活性均隨樣品濃度的升高而增強(qiáng)，青稞芽與其他3種市售谷物芽產(chǎn)品相比抗氧化活性不具有優(yōu)勢(shì)。因此，進(jìn)一步研究青稞萌動(dòng)工藝，通過控制環(huán)境變量或其他萌動(dòng)處理方式來調(diào)節(jié)萌動(dòng)過程中多酚、黃酮、β-葡聚糖及GABA等功能性成分的含量，從而提高萌動(dòng)青稞的抗氧化活性是進(jìn)一步研究的方向。