柑桔砂皮病菌鑒定及室內(nèi)藥劑篩選試驗(yàn)

何永林，黃曉琴，黎起秦，陸 溫，林 緯，袁高慶

（1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.玉林市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣西 玉林 537000）

【研究意義】柑橘砂皮病又叫黑點(diǎn)病、樹脂病、褐色蒂腐病，因各發(fā)病部位、癥狀、時(shí)期不同而有多種名稱。過去柑橘砂皮病屬于次要病害，一般結(jié)合柑橘其他病害對(duì)其進(jìn)行兼治。近些年來，由于低溫凍害、濫用化學(xué)藥劑、管理粗放等原因，導(dǎo)致柑橘砂皮病發(fā)生面積逐漸增加，上升為主要病害，嚴(yán)重影響果實(shí)外觀和品質(zhì)，降低了果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入，對(duì)我國(guó)柑橘生產(chǎn)造成嚴(yán)重制約[1-2]。另外，由于不同病原間以及同種病原不同來源的菌株間對(duì)藥劑的敏感性差異較大[3]。因此，篩選出適用于當(dāng)?shù)馗涕偕捌げ【母咝巹┯兄谔岣呋瘜W(xué)防治效果，同時(shí)增加防治藥劑輪換種類，減少病原菌產(chǎn)生抗藥性的機(jī)率?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】柑橘砂皮病的病原以間座殼屬真菌柑橘間座殼（Diaporthe citri）為主要代表種群，無性態(tài)為柑橘擬莖點(diǎn)霉菌（Phomopsis citri），廣泛分布于世界各大相橘產(chǎn)區(qū)[4-5]。但柑橘砂皮病菌種群組成復(fù)雜，不同地區(qū)病原可能不一定相同。柴思睿對(duì)江西省柑橘黑點(diǎn)病菌種群調(diào)查發(fā)現(xiàn)，除優(yōu)勢(shì)種D.citri之外，還有26個(gè)Diaporthe種可引起柑橘黑點(diǎn)病[6]。廣西是我國(guó)柑橘的最大產(chǎn)區(qū)，當(dāng)?shù)馗涕偕捌げ“l(fā)生普遍, 且呈暴發(fā)趨勢(shì)[7]。目前對(duì)該病的防治除了采用農(nóng)業(yè)措施增強(qiáng)果樹樹勢(shì)外，主要依賴化學(xué)防治。國(guó)內(nèi)防治柑橘砂皮病以代森錳鋅、咪鮮胺、苯并咪唑類、三唑類殺菌劑等為主[8-10]，多為傳統(tǒng)的單劑農(nóng)藥，防治對(duì)象較單一且易產(chǎn)生抗藥性。張?jiān)赖萚11]對(duì)26種殺菌劑對(duì)柑橘砂皮病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定，在治療性殺菌劑中，毒力最高的是250 g/L吡唑醚菌酯，其EC50為0.2001 mg/L；在保護(hù)性殺菌劑中，毒力最高的是80%代森錳鋅，其EC50為3.3946 mg/L；周娜等[12]在測(cè)定33種殺菌劑對(duì)柑桔砂皮病菌的毒力時(shí)發(fā)現(xiàn)，雙胍三辛烷基苯磺酸鹽、氟硅唑、多菌靈、咪鮮胺錳鹽、吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺、戊唑醇、甲基硫菌靈的抑菌效果較強(qiáng)，其EC50在0.0112～1.7296 mg/L之間?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究以廣西柑橘園表現(xiàn)典型砂皮癥狀的病果為試驗(yàn)材料，對(duì)病原菌進(jìn)行分離和鑒定，通過菌絲生長(zhǎng)抑制法測(cè)定了21種藥劑對(duì)柑橘砂皮病菌的抑制作用，從中篩選出抑菌效果好且能兼治柑橘其他病害的藥劑進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分離并鑒定廣西當(dāng)?shù)馗涕偕捌げ【?，篩選更適合當(dāng)?shù)氐母咝V譜藥劑，為田間防治柑橘砂皮病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2017年從廣西桂林富川縣柑橘果園采集表現(xiàn)典型砂皮癥狀的病果，從中分離獲得柑橘砂皮病菌菌株，作為藥劑篩選供試菌株。

供試藥劑：70%代森聯(lián)水分散粒劑（德國(guó)巴斯夫公司），10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑（北京中發(fā)百農(nóng)生物化學(xué)技術(shù)有限公司），50%咪鮮胺懸浮劑（江蘇惠民農(nóng)業(yè)科技有限公司），30%吡唑醚菌酯懸浮劑，25%氟環(huán)唑·噻呋酰胺懸浮劑，250 g/L丙環(huán)唑乳油（陜西美邦農(nóng)藥有限公司），22.5%啶氧菌酯懸浮劑（安陽(yáng)市銳普農(nóng)化有限責(zé)任公司），35%氟環(huán)唑·吡唑醚菌酯懸浮劑（河南豫之星作物保護(hù)有限公司），20%噻菌銅懸浮劑（浙江龍灣化工有限公司），80%代森錳鋅可濕性粉劑（美國(guó)陶氏益農(nóng)公司），1.8%辛菌胺醋酸鹽懸浮劑（西安嘉科農(nóng)化有限公司），46%氫氧化銅水分散粒劑（美國(guó)杜邦公司），12.5%戊唑醇乳油（四川省慧峰植保科技有限公司），50%氯溴異氰尿酸可濕性粉劑（河北上瑞化工有限公司），40%苯醚甲環(huán)唑·吡唑醚菌酯懸浮劑（天津萬(wàn)源新綠生物科技股份有限公司），40%多菌靈懸浮劑（青島杜邦化工集團(tuán)有限公司），47%春雷霉素·王銅可濕性粉劑（青島金爾農(nóng)藥研制開發(fā)有限公司），30%氟環(huán)唑懸浮劑（江西千益化工股份有限公司），80%乙蒜素乳油（河南科邦化工有限公司），24%吡唑醚菌酯·壬菌銅微乳劑（陜西上格之路生物科技有限公司），40%喹啉銅·吡唑醚菌酯懸浮劑、40%喹啉銅懸浮劑（陜西康禾立豐生物科技藥業(yè)有限公司），30%吡唑醚菌酯懸浮劑（陜西美邦農(nóng)藥有限公司）。

1.2 柑橘砂皮病菌的分離與鑒定

采用常規(guī)分離法對(duì)果實(shí)病組織進(jìn)行分離，取2 mm×2 mm的砂皮病組織塊，放入75 %酒精消毒30～60 s，在1%升汞溶液中消毒1 min，用無菌水漂洗3次，將組織塊置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板上，28℃恒溫培養(yǎng)。將分離菌株純化后置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）及燕麥瓊脂（OMA）中28℃下培養(yǎng)，觀察菌落培養(yǎng)性狀、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、分生孢子形狀及顏色，并測(cè)量大小。另外提取菌株的菌絲體DNA，用真菌通用引物ITS4與ITS5對(duì)菌株的rDNA-ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[4]，擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：預(yù)變性94℃5 min，變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，延伸 72 ℃ 45 s，最后 72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)序并通過GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。結(jié)合病原菌的形態(tài)特征，確定其種類。

1.3 21種藥劑對(duì)柑橘砂皮病菌的抑制作用測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法初步測(cè)定藥劑對(duì)柑橘砂皮病菌的抑制作用。將供試的21種藥劑分別與PDA培養(yǎng)基混合制成含藥培養(yǎng)基平板，每種藥劑設(shè)置10、1、0.1μg/mL3個(gè)濃度梯度，每個(gè)藥劑濃度3次重復(fù)。將含相同量無菌水的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照。用5 mm直徑的打孔器選取供試菌株菌落邊緣打孔，將菌餅帶菌絲的一面向下接種到含藥平板中央，置于28 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，以十字交叉法測(cè)量菌落直徑（mm），取其平均值，計(jì)算各藥劑濃度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率：

1.4 5種藥劑對(duì)柑橘砂皮病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

在藥劑初篩選試驗(yàn)基礎(chǔ)上，篩選5種抑菌率高、抑菌譜廣的新型藥劑，測(cè)定其對(duì)柑橘砂皮病菌的室內(nèi)毒力。針對(duì)不同藥劑分別配置一系列濃度梯度，每個(gè)藥劑濃度3次重復(fù)，按照上述菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定各濃度梯度的藥劑對(duì)病菌的抑制率。用SPSS V20軟件統(tǒng)計(jì)分析，將藥劑濃度換算成濃度對(duì)數(shù)（x），菌絲生長(zhǎng)抑制率換算成抑制機(jī)率值（y），計(jì)算毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）及抑制中濃度（EC50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的鑒定

從病果上分離獲得3株形態(tài)特征一致的菌株F-3-1、F-3-2和F-3-3。菌落初期白色、稀疏、羽毛狀，后期暗灰色至黑色、棉氈狀，呈同心輪紋狀擴(kuò)展。在PDA平板上培養(yǎng)60 d未觀察到產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。在OMA上培養(yǎng)30 d左右，菌落產(chǎn)生黑色小點(diǎn)即分生孢子器，分生孢子器近球形，具孔口，分生孢子梗無色近圓柱型。甲型（α）分生孢子橢圓至紡錘形，單孢無色，兩端各含1個(gè)油球，平均大小為8.83 μm×3.81 μm，未觀察到乙型（β）分生孢子。

任選其中1株具有致病力的菌株F-3-3進(jìn)行rDNA-ITS序列的PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序和同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)F-3-3菌株的rDNA-ITS序列與GenBank中的Diaporthe citri的同源性達(dá)99%。結(jié)合形態(tài)特征（圖1），確定從柑橘砂皮病病果上分離得到的菌株F-3-3為D.citri，其無性階段為Phomopsis citri。

圖1 柑橘砂皮病菌F-3-3菌株在燕麥培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀及形態(tài)特征Fig.1 Culture characteristics and morphological characteristics of F-3-3 strain on of D.citri OMA medium

2.2 21種藥劑對(duì)柑橘砂皮病的抑制作用

試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，21種藥劑對(duì)柑橘砂皮病菌菌絲生長(zhǎng)均有抑制效果，藥劑對(duì)病原菌的抑制率與藥劑濃度呈正相關(guān)，表現(xiàn)為供試藥劑濃度越高，菌落直徑越小，抑制率越高。當(dāng)藥劑濃度在最低測(cè)試濃度0.1 μg/mL時(shí)，咪鮮胺、吡唑醚菌酯、氟環(huán)唑·吡唑醚菌酯、戊唑醇、苯醚甲環(huán)唑·吡唑醚菌酯、多菌靈和喹啉銅·吡唑醚菌酯的抑菌率均達(dá)100%，氟環(huán)唑·噻呋酰胺、吡唑醚菌酯·壬菌銅、啶氧菌酯和丙環(huán)唑的抑菌率大于53%，后4種藥劑的濃度增加到1 μg/mL時(shí)，抑菌率均也達(dá)到100%。以上11種藥劑的離體抑菌效果較好；其余殺菌劑濃度為1 μg/mL時(shí)，抑菌率在6.6%～72.6%之間，抑菌效果一般或較差。

表1 21種藥劑對(duì)柑橘砂皮病菌的平均抑制率Table 1 Average inhibition rate of 21 fungicides to D.citri

2.3 5種藥劑的室內(nèi)毒力

從11種離體抑菌效果好的藥劑中選擇5種新型的復(fù)配劑和單劑進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)試。結(jié)果（表2）表明，5種藥劑對(duì)柑橘砂皮病菌都具有很強(qiáng)的抑制作用，其中氟環(huán)唑·吡唑醚菌酯的毒力最高，EC50值為0.053 μg/mL；氟環(huán)唑·噻呋酰胺的毒力最低，EC50值為0.814 μg/mL。5種供試藥劑對(duì)柑橘砂皮病菌的抑制作用從高到低依次為：氟環(huán)唑·吡唑醚菌酯、啶氧菌酯、喹啉銅·吡唑醚菌酯、吡唑醚菌酯·壬菌銅和氟環(huán)唑·噻呋酰胺。

3 討論

陽(yáng)廷密等曾確認(rèn)廣西金柑新發(fā)現(xiàn)的黑點(diǎn)病病原亦為柑橘間座殼[13]。本研究和已知文獻(xiàn)表明，廣西柑橘砂皮病、黑點(diǎn)病、褐色蒂腐病和樹脂病病原的優(yōu)勢(shì)種為D.citri[4]，這與其他柑橘產(chǎn)區(qū)的研究結(jié)果一致。不過另?yè)?jù)報(bào)道，除了D.citri外，廣西柑橘上間座殼菌相關(guān)致病菌還包括D.citrichinensis，但其并不能引起砂皮癥狀[4]。廣西柑橘種植面積大，分布范圍廣，種類多，本試驗(yàn)采集標(biāo)樣有限，當(dāng)?shù)馗涕偕捌げ∈欠駜H由D.citri引起尚待深入研究。

表2 5種藥劑對(duì)柑橘砂皮病菌的室內(nèi)毒力Table 2 Toxicity determination of 5 fungicides on D.citri in laboratory

本試驗(yàn)通過菌絲生長(zhǎng)抑制法對(duì)21種藥劑進(jìn)行初篩選，發(fā)現(xiàn)這些藥劑普遍對(duì)柑橘砂皮病菌有抑制作用，其中三唑類和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的抑菌效果總體上較好。目前國(guó)內(nèi)對(duì)柑橘砂皮病藥劑篩選的報(bào)道以咪鮮胺、代森錳鋅、苯并咪唑類和三唑類殺菌劑等單劑為主[8-10]，前人已驗(yàn)證上述殺菌劑大多對(duì)柑橘砂皮病菌菌絲生長(zhǎng)有很強(qiáng)的抑制作用，EC50值范圍為1.089×10-3～0.954 μg/mL[8,10,14-15]。田間防治效果較好的藥劑有代森錳鋅、吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑等[15-16]。苯并咪唑類、三唑類殺菌劑高效廣譜，具有保護(hù)和治療作用等優(yōu)點(diǎn)，但作用靶標(biāo)單一，大量單獨(dú)使用后病菌易產(chǎn)生抗藥性，且對(duì)其他殺菌劑也會(huì)產(chǎn)生交互抗性[17-18]。美國(guó)對(duì)柑橘黑點(diǎn)病的防治過去主要以銅制劑為主[19]，近年來也開始推廣使用甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，如吡唑醚菌酯和嘧菌酯等[20]。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑是一類高效、低毒、廣譜的內(nèi)吸性殺菌劑，與其他殺菌劑不存在交互抗性，能有效的控制已經(jīng)對(duì)其他殺菌劑產(chǎn)生抗性的植物病害。近年來國(guó)內(nèi)在防治柑橘砂皮病時(shí)也逐漸重視該類殺菌劑[11]，本試驗(yàn)的測(cè)試也進(jìn)一步證實(shí)啶氧菌酯、吡唑醚菌酯以及吡唑醚菌酯與氟環(huán)唑或苯醚甲環(huán)唑的復(fù)配劑對(duì)柑橘砂皮病菌均有較強(qiáng)的抑制作用。但甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑對(duì)細(xì)菌性病害無效，而潰瘍病是嚴(yán)重制約柑橘生產(chǎn)的一種細(xì)菌性病害，防治該病的主要藥劑為銅制劑，分別施用藥劑會(huì)增加防治成本及農(nóng)藥殘留。本試驗(yàn)測(cè)定吡唑醚菌酯與喹啉銅和壬菌銅的復(fù)配劑對(duì)柑橘砂皮病菌的EC50值分別為0.064 μg/mL和0.106 μg/mL，抑菌效果十分明顯。另外，吡唑醚菌酯、啶氧菌酯、氟環(huán)唑?qū)Ω涕俑涕偬烤也『童忦璨∫灿休^好的防治效果[21-23]，因此，本試驗(yàn)選用的復(fù)配劑能有效地增加藥劑抑菌譜，在防治柑橘砂皮病的同時(shí)，還可能兼治柑橘潰瘍病、炭疽病等其他多種病害。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，氟環(huán)唑濃度為1 μg/mL時(shí)對(duì)柑橘砂皮病菌的抑制率為67.7%，但其與噻呋酰胺的復(fù)配劑在同樣濃度下對(duì)病菌的抑制率達(dá)到100%。噻呋酰胺內(nèi)吸性強(qiáng)、持效期長(zhǎng)，主要用于防治紋枯病和白絹病，目前尚未見有噻呋酰胺應(yīng)用于柑橘病害的研究報(bào)道，其單劑及復(fù)配劑對(duì)柑橘砂皮病的防治作用有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

結(jié)合形態(tài)特征觀察和rDNA-ITS序列分析，鑒定廣西柑橘砂皮病病原為柑橘間座殼（Diaporthe citri）；三唑類和甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑對(duì)柑橘砂皮病菌的抑菌效果總體上較好，吡唑醚菌酯·壬菌銅、氟環(huán)唑·噻呋酰胺、喹啉銅·吡唑醚菌酯、氟環(huán)唑·吡唑醚菌酯和啶氧菌酯等5種殺菌劑的EC50范圍為0.053～0.814 μg/mL，為田間防治柑橘砂皮病時(shí)選擇更多輪換藥劑提供了參考。