應(yīng)用丙酸氯倍他索乳膏建立兔激素依賴性皮炎模型及其皮膚病理變化觀察

朱睿 陳茜 徐瑞雪 楊文佳 陳洪鐸 徐天華

[關(guān)鍵詞]激素依賴性皮炎;兔模型;丙酸氯倍他索乳膏;病理變化

近些年來激素依賴性皮炎的患病率逐年增加，這可能與激素的不正當(dāng)使用及應(yīng)用含有激素的護(hù)膚、美容產(chǎn)品有關(guān)[1]。臨床表現(xiàn)為皮膚干燥、脫屑、瘙癢、片狀紅斑、萎縮和對外界刺激敏感等癥狀。但是目前因?yàn)閭惱韱栴}具體皮膚病理表現(xiàn)尚未明確。本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用丙酸氯倍他索乳膏建立兔激素依賴性皮炎模型模擬臨床激素依賴性皮炎發(fā)生發(fā)展過程，動(dòng)態(tài)觀察該疾病的病理變化，為今后治療提供理論基礎(chǔ)及治療思路。

1 材料和方法

1.1 材料：12只成年健康雄性新西蘭大白兔（沈陽寶利恒生物技術(shù)有限公司），0.02%丙酸氯倍他索乳膏（廣東華潤順峰藥業(yè)有限公司），本實(shí)驗(yàn)通過中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審批。

1.2 方法：12只白兔每只背部用動(dòng)物剃毛器機(jī)械剃毛5cm×8cm大小范圍，充分暴露其皮膚，暴露部位皮膚每日1次外涂1/2指尖單位0.02%丙酸氯倍他索乳膏（恩膚霜）連續(xù)80d，于兔背毛再次生長后繼續(xù)機(jī)械剃毛至不再生長。造模開始每5d應(yīng)用數(shù)碼相機(jī)拍照，觀察造模皮膚外觀變化。取造模前及造模后第20、35、50、65及80天各時(shí)間點(diǎn)的皮膚組織進(jìn)行病理活檢，活檢組織置于4%甲醛中固定，石蠟包埋，常規(guī)切片做蘇木素-伊紅染色（HE）在普通光鏡200倍鏡下觀察表皮厚度變化，天狼猩紅染色在普通光鏡200倍及偏振光鏡400倍鏡下觀察真皮中膠原纖維變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：本研究采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用（x?±s）進(jìn)行描述，方差分析進(jìn)行比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 主觀外觀變化：外用0.02%丙酸氯倍他索乳膏第20天可見造模處皮膚潮紅;第35天皮膚潮紅加重、干燥、可見丘疹及小膿皰，無毛發(fā)生長;第50天可見皮膚干燥，片狀紅斑，皮膚干燥附有少量鱗屑;第65天外觀可見片狀紅斑、皮膚明顯變薄、皮下可見毛細(xì)血管，表面干燥脫屑，停藥2d皮膚潮紅、干燥較前更加明顯，繼續(xù)用藥后可緩解，呈現(xiàn)激素依賴性皮炎癥狀。第80天背部皮膚明顯變薄，皮下毛細(xì)血管清晰可見，上附有少許鱗屑，第80天后有4只兔死亡，見圖1。

2.2 皮膚病理變化

2.2.1 表皮：HE染色鏡下觀察表皮厚度變化：第20天表皮較正常比較增厚，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）;第35天表皮厚度較正常比較增厚，薄厚略有不均，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）;第50天表皮厚度較正常比較明顯增厚，薄厚明顯不均（P <0.05）;第65天較正常比較表皮厚度下降、與第50天比較下降明顯，薄厚不均程度較前減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）;第80天表皮厚度較正常比較下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05）;但與第65天比較無明顯差異，表皮厚度趨于均勻，結(jié)果見圖2～3。

2.2.2 真皮：天狼猩紅染色普通顯微鏡200倍鏡下顯示，正常真皮中的膠原纖維含量較多，偏振光鏡400倍鏡下顯示真皮內(nèi)Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維較粗、排列規(guī)則、致密;第20天普通光鏡下真皮中膠原含量較正常皮膚無明顯差異，偏振光鏡下Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維較正常皮膚變得略纖細(xì)、排列稍紊亂;第35天普通光鏡下真皮中膠原纖維含量較正常減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，偏振光鏡下Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維變纖細(xì)、排列松散、扭曲;第50天普通光鏡下真皮中膠原纖維含量較正常明顯減少，差異顯著，偏振光鏡下Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維變得更加纖細(xì)、凌亂;第65天普通光鏡下真皮中膠原纖維較正常明顯減少，差異顯著，偏振光鏡下Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維纖細(xì)、排列紊亂，出現(xiàn)斷裂;第80天普通光鏡下真皮中膠原纖維含量較正常明顯減少，差異顯著，但與第65d比較無差異，偏振光鏡下Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維更加纖細(xì)、排列紊亂、扭曲、斷裂，見圖4～5。通過統(tǒng)計(jì)分析真皮內(nèi)膠原纖維含量隨外用激素時(shí)間延長而逐漸減少，見圖6。主觀外觀及客觀病理變化均證實(shí)激素依賴性皮炎造模成功。

3 討論

目前人們生活水平的提高，對面部美容要求日益提高，從而出現(xiàn)越來越多應(yīng)用護(hù)膚品引起面部皮炎的案例，國內(nèi)把長期應(yīng)用含激素或含有激素的護(hù)膚品引起的皮炎暫稱為激素依賴性皮炎，雖然目前國際尚無統(tǒng)一命名，但臨床表現(xiàn)公認(rèn)為皮膚干燥、脫屑、瘙癢、對外界刺激敏感，片狀紅斑和皮膚萎縮等癥狀[2]。該病發(fā)病機(jī)制也尚未明確，目前主要認(rèn)可的發(fā)病機(jī)制考慮為皮膚屏障功能損傷[3]。

國外學(xué)者Ludger Kolbe等[4]曾用非入侵的方法研究論證激素依賴性皮炎皮膚變化主要為皮膚萎縮而引起屏障功能損傷，屏障功能受損會(huì)增加皮膚的滲透性，進(jìn)而增加藥物的吸收，引起炎癥因子增加和微生物侵襲破壞皮膚功能。國外學(xué)者Schilling等[5]也得出與上述相同推論，他們通過臨床治療并觀察玫瑰痤瘡患者發(fā)現(xiàn)皮膚屏障的損傷可加重毛細(xì)血管的擴(kuò)張，引起炎癥因子增加，造成惡性循環(huán)。

因倫理原因，不能人體實(shí)驗(yàn)取材觀察，為了驗(yàn)證激素依賴性皮炎發(fā)病過程和可能的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以新西蘭白兔為動(dòng)物模型，和以往學(xué)者應(yīng)用香豬、豚鼠、小鼠等動(dòng)物制作該疾病模型[6]比較更經(jīng)濟(jì)實(shí)用，易實(shí)驗(yàn)操作，是更為適合造模的實(shí)驗(yàn)對象。

既往制作激素依賴性皮炎動(dòng)物模型外涂藥物多選用酊劑，因其內(nèi)不含有基質(zhì)成分[7]，減少基質(zhì)對皮膚非特異性增生影響，從而縮短造模時(shí)間。而臨床中激素依賴性皮炎患者的病因多是因?yàn)閼?yīng)用了含有基質(zhì)的激素類乳膏或護(hù)膚品導(dǎo)致，所以應(yīng)用含激素的酊劑外涂造模并不能有效的反映臨床激素依賴性皮炎的實(shí)際病理變化，因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用丙酸氯倍他索乳膏為造模藥物。丙酸氯倍他索乳膏為成品膏劑，內(nèi)含有一些基質(zhì)成分，乳膏中基質(zhì)成分一般含硬脂酸、液狀石蠟、羊毛脂、白凡士林、三乙醇胺等[8]。該乳膏制作動(dòng)物模型雖然較外涂酊劑時(shí)間長，但更能有效模擬臨床激素依賴性皮炎的實(shí)際病理形成過程及可能的發(fā)病機(jī)制。

外用0.02%丙酸氯倍他索乳膏第20天可見造模處皮膚潮紅;第35天皮膚潮紅加重、干燥、可見丘疹及小膿皰，外觀無毛發(fā)生長;第50天可見皮膚干燥，片狀紅斑，皮膚干燥附有少量鱗屑;第65天外觀可見片狀紅斑、皮膚明顯變薄、皮下可見毛細(xì)血管，表面干燥脫屑，停藥2d皮膚潮紅、干燥較前更加明顯，繼續(xù)用藥后可緩解，呈現(xiàn)激素依賴性皮炎癥狀。研究表明激素依賴性皮炎，表皮變化并不一定是持續(xù)變薄，可能由于基質(zhì)的因素會(huì)存在過敏、非特異性炎性增生期，但隨時(shí)間的延長，表皮開始逐漸變薄，所以表皮變薄是激素依賴性皮炎一特征性病理變化[9]。正常真皮中的Ⅰ型膠原為主要成分，約占80%以上，其次為Ⅲ型膠原纖維比例約占10%～15%，Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維為真皮中基質(zhì)的主要成分[ 1 0 ]。造模第20天至第50天模型出現(xiàn)表皮非特異性增生的過程，在第50天表皮厚度達(dá)高峰，但第50天真皮中膠原纖維較正常狀況下卻明顯減少;第65天表皮厚度較正常下降，較第50天厚度明顯降低，真皮中膠原纖維也繼續(xù)明顯減少，真皮中Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維隨激素應(yīng)用時(shí)間的延長而逐漸變得纖細(xì)、扭曲、甚至斷裂。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均與前面的研究相一致，所以進(jìn)一步證實(shí)激素依賴性皮炎病理表現(xiàn)主要為表皮的變薄，真皮膠原纖維的減少、破壞而導(dǎo)致皮膚屏障功能損傷。因造模第80天與第65天表皮及真皮差異均不明顯，且有4只兔外涂激素到80d，出現(xiàn)感染癥狀，最終死亡，考慮可能涂抹面積相對較大，隨時(shí)間延長導(dǎo)致機(jī)體吸收激素過多，引起機(jī)體不良反應(yīng)而死亡，所以結(jié)合造模第65天模型的外觀和病理特點(diǎn)造模已成功。

以上研究結(jié)果給今后用丙酸氯倍他索乳膏建立兔激素依賴性皮炎動(dòng)物模型推薦了造模時(shí)間及外觀表現(xiàn)的數(shù)據(jù)，能成功模擬臨床激素依賴性皮炎疾病的病理變化及發(fā)展過程，為進(jìn)一步臨床診治，如觀察藥物治療、激光和強(qiáng)脈沖光治療[11-12]等提供研究模型。