方格星蟲酶解物對小鼠皮膚創(chuàng)傷修復(fù)的作用

鄭志鴻，章超樺,2，林海生，曾少葵，秦小明，曹文紅

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院// 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室// 廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心// 水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點實驗室，廣東 湛江 524088；2.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，大連工業(yè)大學(xué)，遼寧 大連 116034）

傷口愈合是一種復(fù)雜且高度協(xié)調(diào)的生物修復(fù)活動，主要包含止血期、炎癥期、增殖期和重塑期等一系列階段[1]。當(dāng)機體皮膚遭受創(chuàng)傷后，皮膚的連續(xù)性遭到破壞，損傷部位血管破裂，造成血液流失和局部炎癥反應(yīng)，同時細菌、病毒等環(huán)境污染物容易造成感染，延遲傷口愈合，留下瘢痕，嚴(yán)重則會危及生命，因而必須及時恢復(fù)皮膚完整性，重新建立體內(nèi)平衡機制，預(yù)防感染與減少體液流失，同時預(yù)防異常瘢痕形成。我國每年遭受皮膚急性創(chuàng)傷人數(shù)都超過1 000 萬[2]，研制新的促進創(chuàng)傷愈合制劑具有很高的臨床應(yīng)用價值。

方格星蟲（Sipunculus nudus）又稱沙蟲，國內(nèi)主要分布在北部灣、福建、臺灣等地沿海灘涂[3]，營養(yǎng)豐富，味道鮮甜。我國對方格星蟲的加工利用較少，主要用于鮮銷和加工成干制品，近幾年其深加工價值越來越受到重視，其活性研究和應(yīng)用也日益廣泛?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明方格星蟲具有抗氧化[4]、抗疲勞[5-7]、抗病毒[8]、調(diào)節(jié)免疫[9-11]、抗菌[12-13]、抗炎和外周鎮(zhèn)痛[14]等功效，其中免疫調(diào)節(jié)、抗菌和抗炎功效與傷口愈合密切相關(guān)。研究團隊前期研究表明，方格星蟲酶解產(chǎn)物具有免疫調(diào)節(jié)功能[10]，同時方格星蟲中精氨酸含量極高[15]。精氨酸的攝入可以降低機體氮的損失，具有促進傷口愈合的功能[9]。又有研究表明，可口革囊星蟲膠原蛋白可以促進皮膚創(chuàng)傷修復(fù)[16]，作為同屬的方格星蟲也可能有相似功效。本試驗擬制備方格星蟲酶解物，并從止血期、炎癥期、增殖期探討其促傷口愈合的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與原料 選取體重為(20.0 ± 2.0)g的SPF 級KM 小鼠，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。動物生產(chǎn)許可證為：SCXK（魯）20140007。于23～ 25 ℃、相對濕度為50%～ 60%進行日常飼養(yǎng)，自由飲水，進食。自湛江市東風(fēng)市場購買方格星蟲成蟲，直徑5～ 7 mm，長8～ 12 cm，去除泥沙、內(nèi)臟和體腔液，蒸餾水洗凈體壁，瀝干后，于-20℃貯藏。

1.1.2 試劑 動物水解蛋白酶（2×105U/g）、風(fēng)味蛋白酶（2×105U/g），廣西南寧龐博生物科技有限公司；ELISA 試劑盒、羥脯氨酸試劑盒（堿水解法），南京建成生物工程研究所；云南白藥，云南白藥集團股份有限公司；醫(yī)用酒精、生理鹽水、水合氯醛，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

Thermo Varioskan Flash 多功能全自動酶標(biāo)儀、Thermo Lynx6000 高速落地離心機，美國Thermo公司PHS-25 pH 計，上海康儀儀器有限公司；R1005 DL 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；G50組織研磨儀，卡尤迪生物科技（北京）有限公司；Rapid-Core 打孔器，美國EMS 公司；FB224 電子分析天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 方格星蟲酶解物制備工藝 參照研究團隊前期酶解工藝[10]，將方格星蟲充分絞碎，調(diào)節(jié)pH至7.0，按料液比1∶3（g/mL），2 500 U/g 分別加入動物水解蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，充分勻漿，55℃恒溫攪拌水浴鍋，提取5 h，沸水浴滅酶10 min，以8 000g離心20 min，取上清液旋蒸濃縮，冷凍干燥得方格星蟲酶解物（以下簡稱SNH）。

1.3.2 方格星蟲酶解物體外止血活性研究 27 只小鼠，體質(zhì)量 30～ 35 g，隨機均分為空白組（none-treatment，NT）、SNH 組和云南白藥對照組（positive control，PC），將小鼠置于特定容器中固定，并使其尾巴呈水平狀態(tài)露出，用醫(yī)用手術(shù)剪于尾端0.4 cm 處截斷，用醫(yī)用棉簽粘取藥物輕輕包裹于鼠尾斷面，SNH 組蘸取1 g·kg-1給藥，PC 組也用醫(yī)用棉簽蘸取1 g·kg-1；NT 組不給藥，開始計時，每隔10 s 用濾紙輕輕吸取尾巴流下的血滴，不可擠壓傷口,記錄濾紙不再粘下血跡所用時間，為止血時間。

1.3.3 建立傷口模型 將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機分為3 組，分別為NT 組、SNH 組和PC 組。將老鼠以350 mg·kg-1水合氯醛麻醉，背部去毛，消毒后，用直徑8 mm 圓形醫(yī)用打孔器于老鼠背部切取全層皮膚，深至筋膜，形成全皮層皮膚創(chuàng)傷動物模型，分籠飼養(yǎng)。SNH 組以SNH（以氮計）與水質(zhì)量比2∶1 配成膏狀，涂抹傷口，涂滿為止；PC組也以涂滿為主，NT 組不予給藥。每天給藥一次。每2 d 固定高度拍照一次，用Image J 軟件分析計算傷口愈合率，計算公式：

式中S0代表0 d 創(chuàng)面面積，SN代表Nd 創(chuàng)面面積，單位：mm2，其中N=0,2,4,…,14。

1.3.4 ELISA 分析 將造模3、5 和7 d 后的小鼠，各組分別處死5 只，剪取創(chuàng)面全層皮膚及創(chuàng)周2.0 mm 的正常皮膚，參照南京建成相應(yīng)的ELISA 試劑盒說明書測定創(chuàng)面中的腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β) 和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的濃度 。

1.3.5 HE 染色切片分析 造模后7 d，取創(chuàng)面全層皮膚及創(chuàng)周皮膚對半切開，用體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定12 h，經(jīng)脫水、包埋和切片，制成石蠟切片，用蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin stain,HE)染色，觀察痂覆蓋下的創(chuàng)面寬度。

1.3.6 羥脯氨酸含量測定 取造模后7 d 和14 d 小鼠創(chuàng)面及周邊的皮膚一半用于測定羥脯氨酸含量，參照南京建成的羥脯氨酸試劑盒（堿水解法）說明書進行測定。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用JMP10、Image J 和Origin9.0 軟件統(tǒng)計分析、處理圖片和作數(shù)據(jù)圖。結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，所有圖片圖注中的n代表動物個數(shù)。對所有數(shù)據(jù)進行組間差異性顯著分析，采用最小二乘均值studentt檢驗。組間統(tǒng)計顯著性水平α值：組間大寫字母表示α=0.01，組間小寫字母表示α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 止血作用分析

各組止血時間如圖1 所示，SNH 組和PC 有相似的止血效果，出血時間無顯著性差異，均顯著短于NT 組。各組出血時間分別為：NT (236.75 ± 62.61)s、SNH (120.00 ± 41.50) s 和PC (86.17 ± 67.41) s。

圖1 SNH 對小鼠尾部出血時間的影響Fig.1 Effects of SNH (Sipunculus nudus hydrolysate)treatment on tail bleeding time in mice

2.2 創(chuàng)面愈合率

各組創(chuàng)面愈合情況如圖2 所示，隨著傷后時間延長，各組小鼠創(chuàng)面面積均逐漸減小，造模后2 d均有軟痂覆蓋傷口。如圖3 所示，SNH 組在造模后2 d 至14 d 的創(chuàng)面愈合率均顯著高于NT 組，PC 組在造模后2 d 至6 d 以及造模后14 d 的創(chuàng)面愈合率均顯著高于NT 組，SNH 組與PC 組比較均無顯著性差異。在造模后8 d，各組愈合率分別為SNH 組[(82.78 ± 8.63)%]Aa、PC 組[(71.48 ± 5.48)%]Aab和NT組[(59.03 ± 22.68)%]Ab；造模后14 d，為SNH 組[(99.62 ± 0.80)%]Aa、PC 組[(96.27 ± 4.39)%]ABa和NT 組[(89.35 ± 5.37)%]Bb。圖4 所示是各組掉痂時間，分別為：SNH 組[(12.8 ± 0.6)d]Bc、PC 組[(14.0 ±1.4)d]Bb和NT 組[(17.0 ± 1.5)d]Aa。SNH 組掉痂時間顯著短于PC 組和NT 組，PC 組顯著短于NT 組。

2.3 創(chuàng)面組織中 IL-1β 和TNF-α 水平

創(chuàng)面中的IL-1β 水平如圖5 所示，造模后3 d，SNH 組和PC 組 IL-1β 水平明顯高于NT 組。造模后5 d，SNH 組和PC 組IL-1β 水平顯著下降，與NT組無顯著差異。造模后7 d，SNH組和PC組IL-1β水平顯著低于NT 組。創(chuàng)面中的TNF-α 水平如圖6所示，造模后3 d，SNH 組和NT 組TNF-α 水平無明顯差異，PC 組TNF-α 水平顯著大于SNH 組和NT 組。造模后5 d，SNH 組和PC 組TNF-α 水平有所下降，其中SNH 組的TNF-α 水平顯著低于NT組和PC 組，PC 組與NT 組無顯著差異。造模后7 d，SNH 組和PC 組TNF-α 水平顯著低于NT 組。

圖2 宏觀觀察NT、SNH 和PC 組小鼠傷口的愈合情況Fig.2 Macroscopic observation of the wound healing of NT,SNH and PC group

圖3 SNH 對小鼠皮膚創(chuàng)傷愈合率的影響Fig.3 Effect of SNH group on wound closure in mice

圖4 掉痂所用的時間Fig.4 Time of scab removal

圖5 SNH 對皮膚創(chuàng)面IL-1β 的影響Fig.5 Effect of SNH on IL-1β in wound of mice

圖6 NH 對皮膚創(chuàng)面TNF-α 的影響Fig.6 Effect of SNH on TNF-α in wound of mice

2.4 創(chuàng)面組織的TGF-β1 水平

SNH 對小鼠創(chuàng)面組織TGF-β1 的影響，如圖7所示。造模后7 d，相比于NT 組和PC 組，SNH 組創(chuàng)面組織TGF-β1 濃度顯著降低，NT 組和PC 組無顯著性差異。造模后14 d，SNH 組TGF-β1 濃度保持比較低的濃度，顯著低于NT 組，與PC 組無顯著性差異。

圖7 SNH 對小鼠創(chuàng)面TGF-β1 的影響Fig.7 Effect of SNH on TGF-β1 in wound of mice

2.5 HE 染色切片分析

在造模7 d 后，用HE 染色測定各組對創(chuàng)面收縮的影響。如圖8 所示，圖中雙向箭頭之間寬度代表創(chuàng)面寬度，在痂的掩蓋下，創(chuàng)口已經(jīng)收縮修復(fù)，實現(xiàn)部分表皮再上皮化。各組寬度如圖9 所示，分比為SNH 組(2.92 ± 0.22)mm 和PC 組(3.51 ±0.21)mm 均顯著小于NT 組(4.58 ± 0.48)mm，其中SNH 組還顯著小于PC 組。

圖8 傷口組織HE 染色切片觀察（造模后7 d）Fig.8 Histological observation of HE stained sections of wound at 7 days post-wounding

2.6 創(chuàng)面組織中羥脯氨酸的含量

SNH 對小鼠創(chuàng)面組織中羥脯氨酸含量的影響，如圖10 所示。各組創(chuàng)面組織中的羥脯氨酸含量均隨著時間的增加呈升高的趨勢。在造模后7 d，NT組、SNH 組、PC 組和正常皮膚（normal skin,NS）羥脯氨酸含量分別為(4 158 ± 526) μg/mg、(4 820 ±1 066) μg/mg、(4 139 ± 1 404) μg/mg 和(9 327 ± 885)μg/mg，NT 組、SNH 組和PC 組無顯著差異。造模后14 d，NT 組、SNH 組、PC 組和NS 組羥脯氨酸含量分別為(6 811 ± 1 172) μg/mg、(8 201 ± 431)μg/mg、(8 466 ± 1 086) μg/mg 和 (9 327 ± 885)μg/mg，SNH 組顯著高于NT 組，與PC 組、正常皮膚無顯著差異，這表明SNH 和云南白藥有相似的功效，可以促進膠原蛋白在創(chuàng)面的沉積。

圖10 SNH 對小鼠創(chuàng)面中羥脯氨酸含量的影響Fig.10 Effect of SNH on hydroxyproline content in wound of mice

3 討論

造模后，SNH 組從造模后2 d 起，傷口愈合率一直顯著高于NT 組，造模后7 d HE 染色切片表明SNH 組創(chuàng)面寬度顯著小于PC 組和NT 組，可以促進創(chuàng)面收縮。造模后12 d，SNH 幾乎完全愈合，造模后14 d，愈合后周邊長滿毛發(fā)，疤痕不明顯，而NT 組14 d 時愈合率才(89.35 ± 5.37)%。此外，SNH組比NT 組早4.2 d 掉痂，比PC 組早1.2 d 掉痂，PC 組比NT 組早3 d 掉痂。這樣的結(jié)果可能與SNH和云南白藥在傷口愈合過程中快速止血、調(diào)節(jié)炎癥因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β1 的表達和促進膠原沉積有密切聯(lián)系。

SNH 組的止血時間顯著短于NT 組，和PC 組無顯著差異。據(jù)報道，云南白藥可以增強血小板活化率，加速血小板向創(chuàng)面的聚集速度，縮短出血，具有很強的止血和促愈合效果[17]。這暗示SNH 在創(chuàng)傷后可以快速止血，減少體液流失，也減少細菌、病毒等環(huán)境染污物感染血液，其作用機制可能與方格星蟲中的鈣元素含量較高有關(guān)[6,18]，其中鈣離子是凝血因子IV，同時是多種凝血因子的輔因子，可以加速凝血酶的形成，參與凝血途徑多個環(huán)節(jié)[19]。

從炎癥反應(yīng)來看，云南白藥具有增強吞噬細胞的吞噬功能，提高機體免疫力，加速清創(chuàng)、消腫止痛等抗炎功效[17]。創(chuàng)傷前期SNH 組和PC 組一樣，均促進炎癥因子分泌，可以進一步激活炎性細胞，有助于傷口清除組織碎片、環(huán)境污染物，促使傷口快速清創(chuàng)[20]。此外，有研究報道方格星蟲酶解物具有促進淋巴細胞增殖和巨噬細胞吞噬的作用[10]。造模后7 d，SNH 組和PC 組的IL-1β 和TNF-α 均下降到比較低的水平，而NT 組則保持比較高的水平（圖5、6），這表明SNH 不會導(dǎo)致過度炎癥，致使愈合受損，這與Zhang 所提取的方格星蟲水提物相似，具有一定的抗炎性，其方格星蟲水提物對角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠后爪水腫、右旋糖酐誘導(dǎo)的大鼠足爪水腫、大鼠棉球肉芽腫、角叉菜膠誘導(dǎo)的腹膜炎、二甲苯誘導(dǎo)的小鼠耳水腫均有抑制作用[14]。炎癥反應(yīng)具有雙面性，對于抵抗外源性異物和清除受損組織具有至關(guān)重要作用，可以保護組織免受外來抗原的侵害。然而，強烈持久的炎癥會傷害自身正常組織，導(dǎo)致愈合受損[20-22]，是與纖維化病理有關(guān)的發(fā)病的主要原因[23]。據(jù)報道，胎兒創(chuàng)傷和口腔黏膜傷口都表現(xiàn)出輕微的炎癥水平，它們均能快速無疤痕愈合[24-27]。同時，IL-1β 和TNF-α 會以劑量依賴的方式來減少膠原合成[28]，其中TNF-α 對基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)有較強的促分泌作用，可促進膠原降解，對I/III 型前膠原信使RNA（Ribonucleic Acid，mRNA）轉(zhuǎn)錄具有阻斷作用[29]，不利于細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的合成，這都會致使愈合受損。

在愈合過程中，TGF-β1 是主要纖維化驅(qū)動因子，它與許多異常瘢痕的形成相關(guān)[30-32]。在胎兒傷口中，添加外源性TGF-β1 會導(dǎo)致與成年人一樣的瘢痕形成作用[33]。造模7 d 后，相比于NT 組和PC組，SNH 組顯示出比較低的TGF-β1 含量，這暗示SNH 可能有比較好的抗瘢痕效應(yīng)。有研究表明在表皮上皮化的過程中，TGF-β1 抑制角質(zhì)形成細胞和內(nèi)皮細胞的增殖和存活[34]，不利于血管生成和表皮再上皮化，而SNH 組TGF-β1 含量一直保持比較低的水平，低濃度的TGF-β1，還可以通過影響α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)、組織金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)和MMP 的mRNA 表達水平，使ECM 的合成與分解處于一種動態(tài)的平衡，促進ECM 的重塑，改善傷口表觀[35]。

羥脯氨酸是膠原蛋白特異性成分，其占比相對比較固定，可用于創(chuàng)面中膠原蛋白的定量測定。據(jù)報道，云南白藥能促進結(jié)締組織的生長和血管的生成，加速形成肉芽[17]。造模后7 d，SNH 組羥脯氨酸含量高于NT 組，但無顯著性差異，造模后14 d，SNH 組羥脯氨酸含量顯著高于NT 組，與PC 組、正常皮膚無顯著性差異，這代表了長期上藥之后，SNH 組膠原的沉積顯著優(yōu)于NT 組，與PC 組一樣具有促進膠原沉積的作用，其羥脯氨酸含量已經(jīng)接近正常皮膚。原因也可能是SNH 本身作為ECM 基料，用于合成膠原蛋白，促進膠原沉積。

4 結(jié)論

綜上所述，方格星蟲酶解物能通過有效止血、調(diào)節(jié)炎癥、轉(zhuǎn)化生長因子-β1 以及加速膠原蛋白合成促進皮膚創(chuàng)傷愈合。