過熱蒸汽對(duì)熟制小龍蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌的殺菌動(dòng)力學(xué)及其機(jī)理

張澤偉，段偉文，陳 銘，鄧楚津，劉書成,2,3,4，吉宏武,2,3,4

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院/ 2.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 3.廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心/4.水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

小龍蝦，學(xué)名克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），自1929 年引入我國(guó)后，被大范圍推廣養(yǎng)殖。2016 年，我國(guó)已是全世界最大小龍蝦生產(chǎn)國(guó)，其加工產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的同時(shí)也遇到了諸多問題[1-2]。與其他冷藏水產(chǎn)品相比，小龍蝦含有較多自由氨基酸，致使其更容易遭受微生物作用而腐敗變質(zhì)，貨架期較短，成為限制小龍蝦產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的主要障礙[3]。如何有效地殺滅小龍蝦產(chǎn)品中腐敗菌，前人已有相關(guān)殺菌方式的研究報(bào)道。其中巴氏滅菌能較大程度保持小龍蝦產(chǎn)品滅菌后品質(zhì)，但殺菌效果不理想。高溫高壓滅菌能較好殺滅微生物，但對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味與口感等影響較大[4]。因此選擇合適殺菌方式是小龍蝦產(chǎn)業(yè)急需解決的問題。

過熱蒸汽是指在恒定的壓力下對(duì)飽和蒸汽繼續(xù)加熱，使其溫度升高到相應(yīng)沸點(diǎn)以上的高溫水蒸氣[5]。與傳統(tǒng)熱處理方式相比，過熱蒸汽的傳熱方式除對(duì)流傳熱和輻射傳熱，還有冷凝傳熱；在殺菌過程中蒸汽在物料表面冷凝，釋放大量的熱，使物料快速升溫同時(shí)大幅度殺滅微生物，縮短殺菌時(shí)間，保障產(chǎn)品品質(zhì)。且在殺菌過程中過熱蒸汽提供低氧環(huán)境，避免氧化反應(yīng)，降低有害物生成。近些年過熱蒸汽殺菌作為一種綠色熱加工技術(shù)而備受關(guān)注[6]。目前，研究已發(fā)現(xiàn)過熱蒸汽對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）[7]、嗜熱芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus）[8]、沙門氏菌（Salmonella）[9]等微生物具有良好的殺菌效果。然而，過熱蒸汽殺菌技術(shù)對(duì)小龍蝦產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌殺滅效果的研究尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。

微生物殺菌動(dòng)力學(xué)研究是殺菌技術(shù)運(yùn)用的關(guān)鍵理論之一，它可以定量評(píng)價(jià)殺菌的效果、提供合適的殺菌設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)殺菌技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用具有理論指導(dǎo)意義[10]。目前，已研究多種殺菌技術(shù)對(duì)不同微生物的殺菌動(dòng)力學(xué)，例如超聲輔助超臨界CO2殺滅大腸桿菌（E.coli）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的動(dòng)力學(xué)[11]，微波和巴氏滅菌殺滅大腸桿菌O157：H7（Escherichia coliO157：H7）和李斯特菌（Listeria monocytogenes）的動(dòng)力學(xué)[12]和過熱蒸汽殺滅沙門氏菌和蠟樣芽孢桿菌的殺菌動(dòng)力學(xué)[13]。然而，過熱蒸汽對(duì)小龍蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌的殺菌動(dòng)力學(xué)還未見有研究報(bào)道。

本研究以從腐敗小龍蝦產(chǎn)品中分離的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為研究對(duì)象，研究不同條件下過熱蒸汽溫度、流量和處理時(shí)間對(duì)小龍蝦產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌的殺菌效果及動(dòng)力學(xué)，并初步探究其殺菌機(jī)理，以期獲得過熱蒸汽殺滅小龍蝦產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌的最佳條件，為指導(dǎo)過熱蒸汽在小龍蝦產(chǎn)品加工中的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活小龍蝦（Procambarus clarkii），30～ 36 尾/kg，購(gòu)于廣東省湛江市霞山區(qū)東風(fēng)海鮮市場(chǎng)；營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)、PCA 平板計(jì)數(shù)瓊脂、革蘭氏染色試劑盒，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；Taq DNA 聚合酶、PCR引物，生工生物工程(上海)股份有限公司；基因組DNA 提取試劑盒，天根生化科技有限公司；體積分?jǐn)?shù)25%戊二醛、無水乙醇、叔丁醇，均為分析純，廣東光華科技股份有限公司。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備

JSM-7610F 掃描電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社；SW-CJ-FD 潔凈雙人工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；Hema 9600 PCR 基因擴(kuò)增儀，珠海黑馬醫(yī)療儀器有限公司；SLI-700 埃朗生化培養(yǎng)箱，東京理化器株式會(huì)社；HZQ-X100 全溫振蕩培養(yǎng)箱，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FDU-1100 真空冷凍干燥設(shè)備，東京理化器械株式會(huì)社；Aglient Cary 60 紫外-可見光光度計(jì)，美國(guó)安捷倫科技公司；DDSJ-308A 電導(dǎo)率儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；過熱蒸汽處理系統(tǒng)，自制[14]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備 新鮮小龍蝦→超聲清洗→瀝干→油炸（170 ℃油炸3 min）→煮制（含5 g/100 mL食鹽的沸水中煮10 min）→冷卻→真空包裝→25 ℃下貯藏。

1.3.2 貯藏期間菌落總數(shù)與揮發(fā)性鹽基氮含量測(cè)定 每天測(cè)定熟制小龍蝦的菌落總數(shù)與揮發(fā)性鹽基氮含量。菌落總數(shù)測(cè)定方法參照GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》；揮發(fā)性鹽基氮采用自動(dòng)凱氏定氮儀法測(cè)定，參照GB 5009.228-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》。

1.3.3 腐敗菌的分離純化與鑒定 選取貯藏終點(diǎn)的小龍蝦樣品，在無菌超凈臺(tái)中將小龍蝦去頭、去殼，稱取25 g 蝦肉，用無菌剪刀剪碎后放入盛有225 mL 無菌生理鹽水的錐形瓶中，均質(zhì)。按10 倍系列稀釋，稀釋至10-5。取100 μL 菌懸液均勻涂抹在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，在37 ℃下，恒溫培養(yǎng)48 h 左右。挑選一個(gè)合適的平板（菌落數(shù)約30～100 CFU）計(jì)數(shù)，并挑起平板上全部可見菌落，進(jìn)行編號(hào)，連續(xù)進(jìn)行3 次劃線分離。用體積分?jǐn)?shù)為20%甘油-80 ℃保存，以備后用。根據(jù)革蘭氏染色、細(xì)菌形態(tài)和菌落特征將獲得的菌株分組。將所有純菌株進(jìn)行16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增，其產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序[15]。將測(cè)序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST 系列分析，選取相似性99%以上菌株的基因序列，利用MEGA5.1 軟件進(jìn)行鄰近法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 菌懸液的配制 用接種環(huán)挑取一環(huán)小龍蝦的優(yōu)勢(shì)腐敗菌接入無菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）中，180 r/min、37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，連續(xù)重復(fù)3 次[16]。將培養(yǎng)好的細(xì)菌菌懸液離心（5 000 r/min,15 min，4℃）。棄去上清液，將沉淀物重新懸浮在生理鹽水中至所需濃度，濃度范圍為108～ 109CFU/mL[17]。

1.3.5 過熱蒸汽殺菌實(shí)驗(yàn)過程 首先設(shè)置好過熱蒸汽儀器的溫度、流量等參數(shù)（溫度參數(shù)為170、200、230 ℃，流量參數(shù)為19、24、29 m3/h），待整個(gè)系統(tǒng)溫度和流量穩(wěn)定后，關(guān)閉閥門，快速將3根裝有4 mL 菌懸液的18mL 玻璃試管放在物料放置架上，關(guān)閉箱門。重新打開蒸汽閥門，同時(shí)記錄殺菌時(shí)間（殺菌時(shí)間為40、70、100、150、200、250、300 s）。殺菌完成后，將試管立即放入冰水中冷卻，直至微生物計(jì)數(shù)檢測(cè)[18]。

1.3.6 微生物計(jì)數(shù) 參照方法1.3.2 中菌落總數(shù)測(cè)定的方法檢測(cè)腐敗菌在過熱蒸汽處理前、后的數(shù)量。過熱蒸汽的殺菌效果采用微生物殘活率表示，見公式（1）。

過熱蒸汽處理前的菌懸液的菌落總數(shù)記為N0（CFU/mL）；過熱蒸汽處理后菌懸液的菌落總數(shù)記為N（CFU/mL）。

1.3.7 殺菌機(jī)理的菌懸液制備 按照1.3.4 的方法配制菌懸液，再按照1.3.5 的方法對(duì)菌懸液進(jìn)行殺菌，具體的過熱蒸汽殺菌條件：過熱蒸汽溫度230 ℃、流量29 m3/h，處理時(shí)間分別為：0、40、70、100、150、200、250 s。

1.3.8 菌懸液電導(dǎo)率測(cè)量 對(duì)按照1.3.7 的方法所制備的菌懸液，使用電導(dǎo)率儀測(cè)定其電導(dǎo)率值。

1.3.9 菌懸液紫外吸收測(cè)量 對(duì)按照1.3.7 的方法所制備的菌懸液進(jìn)行離心（5000 r/min,15 min，4 ℃），取上清液，在波長(zhǎng)260 nm 處測(cè)定其吸光值。

1.3.10 細(xì)菌微觀形態(tài)的觀察 借助掃描電子顯微鏡對(duì)小龍蝦產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)腐敗菌菌株細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。對(duì)按照1.3.7 的方法所制備的菌懸液進(jìn)行離心（5 000 r/min,15 min，4 ℃，棄去上清液，下同），再加入0.1 mol/L pH＝7.0 的PBS 緩沖液，離心。加入適量的體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛溶液固定過夜后離心。加入PBS 緩沖液，離心，重復(fù)3 次。分別加入30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇逐級(jí)洗脫，每級(jí)洗脫10 min，離心，其中100%的乙醇洗脫2 次，其余洗脫1 次。再加入無水乙醇與叔丁醇（體積比＝1∶1）洗脫15 min，離心。最后叔丁醇洗脫15 min，離心。得到的菌泥再經(jīng)真空冷凍干燥后，固定在金屬箔片上，噴金80 s，電鏡觀察。

1.4 殺菌動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型--Weibull 模型

式中，b為尺度參數(shù)，n為形狀參數(shù)，t為過熱蒸汽處理時(shí)間(s)。當(dāng)n=1，曲線為一條直線，此時(shí)Weiibull 模型為一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程；當(dāng)n＞ 1，曲線呈凸形；當(dāng)n＜ 1，曲線呈凹形。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用Origin 8.5 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 熟制小龍蝦貯藏期間菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮變化

菌落總數(shù)直接反映熟制小龍蝦產(chǎn)品被細(xì)菌污染的程度和是否符合衛(wèi)生要求，所以菌落總數(shù)在一定程度上表示小龍蝦產(chǎn)品是否具有可食性。揮發(fā)性鹽基氮含量表示小龍蝦產(chǎn)品由于受到微生物和酶的作用，本身蛋白質(zhì)被分解產(chǎn)生氨和胺類等堿性含氮物質(zhì)的程度[19]。圖1 是熟制小龍蝦在常溫下（25 ℃）貯藏過程中菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮含量的變化，由圖1 可知，貯藏期間小龍蝦菌落總數(shù)一直持續(xù)增長(zhǎng)，揮發(fā)性鹽基氮含量先緩慢增加后急劇上升。孫亞軍等[20]研究南美白對(duì)蝦蝦仁貯藏期間揮發(fā)性鹽基氮的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性鹽基氮含量先緩慢增加后快速增加。熟制小龍蝦貯藏期間揮發(fā)性鹽基氮含量的增長(zhǎng)規(guī)律與其類似。這是由于貯藏前期，產(chǎn)品微生物的數(shù)量較少，蛋白質(zhì)被分解的程度較低，堿性含氮物質(zhì)的含量較少。隨著貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，微生物數(shù)量增加，分解作用變強(qiáng)，從而使揮發(fā)性鹽基氮含量增加[21]。根據(jù)GB 10136-2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物性水產(chǎn)制品》，判定熟制小龍蝦達(dá)到腐敗終點(diǎn)的菌落總數(shù)限量為 5×104CFU/g，揮發(fā)性鹽基氮限定值為30 mg/100 g。貯藏2 d，小龍蝦的菌落總數(shù)為4.47×105CFU/g，已超過限定值，此時(shí)揮發(fā)性鹽基氮含量為19.45 mg/100 g還未超標(biāo)，揮發(fā)性鹽基氮指標(biāo)滯后于菌落總數(shù)指標(biāo)。綜合來看，貯藏2 d 的熟制小龍蝦已腐敗變質(zhì)，到達(dá)貨架期的終點(diǎn)。

圖1 熟制小龍蝦菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮含量隨貯藏時(shí)間的變化Fig.1 Change in total bacterial count and TVB-N value of cooked crayfish during storage

2.2 小龍蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離與鑒定

根據(jù)1.3.3，從稀釋度為10-3的平板上共挑取56 個(gè)菌落，然后分別劃線分離純化。根據(jù)圖2 可知，小龍蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可判定A1 號(hào)菌為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）；B2 號(hào)菌為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）；C12號(hào)菌為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）；D4 號(hào)菌為賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus macroides）。它們均為革蘭氏陽性菌，并分別占挑取分離總菌落的19.64%、14.29%、42.86%和23.21%。

圖2 4 種優(yōu)勢(shì)腐敗菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of four dominant spoilage bacteria

從小龍蝦產(chǎn)品中分離出的蠟樣芽孢桿菌和賴氨酸芽孢桿菌與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[22]。而解淀粉芽孢桿菌和短小芽孢桿菌是首次在腐敗小龍蝦產(chǎn)品中被發(fā)現(xiàn)。在真空包裝中，革蘭氏陽性菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于革蘭氏陰性菌[23]。蠟樣芽孢桿菌、解淀粉枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌均被認(rèn)為是熟制食品的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，均在小麥面包[24]、魚糜[25]和烤雞[26]等中被發(fā)現(xiàn)。因煮制的殺菌溫度較低，同時(shí)解淀粉枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌具有良好耐熱性，所以他們能夠在煮制過程中存活并在貯藏期間生長(zhǎng)繁殖。因此解淀粉枯草芽孢桿菌和短小芽孢桿菌能夠在經(jīng)煮制后的小龍蝦產(chǎn)品中大量存在并成為小龍蝦的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

2.3 過熱蒸汽溫度和殺菌時(shí)間對(duì)小龍蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌的殺菌動(dòng)力學(xué)

研究過熱蒸汽流量為24 m3/h、不同過熱蒸汽溫度和殺菌時(shí)間對(duì)4 種優(yōu)勢(shì)腐敗菌的滅活效果，其結(jié)果如圖3 所示。在整個(gè)殺菌過程，隨著殺菌時(shí)間延長(zhǎng)，微生物殘活率持續(xù)下降，直到完全殺滅。但整個(gè)過程，微生物殘活率下降的速率是不同的。在殺菌初始階段，4 種優(yōu)勢(shì)腐敗菌的殘活率均迅速下降，并呈現(xiàn)類似的趨勢(shì)。然后隨著過熱蒸汽處理時(shí)間的延長(zhǎng)，4 種優(yōu)勢(shì)腐敗菌的殘活率變化緩慢，趨于平緩。此外，過熱蒸汽對(duì)4 種小龍蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌的殺菌動(dòng)力學(xué)所擬合的生存曲線均為“拖尾”曲線。這是由于在過熱蒸汽處理初期，過熱蒸汽遇見冷試管時(shí)，蒸汽在試管表面冷凝，釋放出大量的熱量并傳遞給菌懸液，使其溫度快速升高，從而快速的殺死菌懸液中存活的細(xì)菌。隨著過熱蒸汽的處理，菌懸液中存在的熱敏性細(xì)菌個(gè)體被殺滅，留下耐熱性較強(qiáng)的細(xì)菌個(gè)體，導(dǎo)致殘活率下降速率變慢[27]。上述趨勢(shì)與過熱蒸汽殺滅嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子（Geobacillus stearothermophilusspores）的過程類似[28]。這種趨勢(shì)不僅與殺菌工藝有關(guān)，還與細(xì)菌細(xì)胞壁有關(guān)。4 種小龍蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌均為革蘭氏陽性菌。革蘭氏陽性菌擁有多層肽聚糖和磷壁酸組成的堅(jiān)固和厚實(shí)的細(xì)胞壁，磷壁酸有助于加強(qiáng)細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度，從而提高細(xì)菌熱耐性[29]。

殺菌效果也受過熱蒸汽溫度的影響。過熱蒸汽對(duì)4 種小龍蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌的滅活效果與過熱蒸汽溫度呈正相關(guān)。在相同殺菌時(shí)間，過熱蒸汽溫度為230 ℃的殺菌效果要優(yōu)于170 ℃。較高過熱蒸汽溫度使蒸汽在冷凝時(shí)釋放大量的熱和較強(qiáng)的氣體輻射，因此使菌懸液的溫度上升得更快，具有更高的微生物殺菌效率[30]。同時(shí)，不同腐敗菌對(duì)不同過熱蒸汽溫度有不同的反應(yīng)。蒸汽溫度170 ℃，殺菌時(shí)間為250 s 時(shí)，解淀粉芽孢桿菌的殘活率為-6.88，而在相同條件下，其他菌株對(duì)應(yīng)的殘活率均＜-8。在相同溫度條件下，其殘活率不同，可能與菌株本身的耐熱性有關(guān)。在4 種小龍蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌中，B2菌株的耐熱性最強(qiáng)。BOUKHRIS I 等發(fā)現(xiàn)解淀粉樣芽孢桿菌具有很強(qiáng)耐熱性[31]?？傊?，過熱蒸汽對(duì)4種小龍蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌有較好的殺菌效果。過熱蒸汽處理（200 ℃，250 s；230 ℃，200 s）后，其殘活率均＜-8，殺菌效果均能達(dá)到近100%的致死率。

2.4 過熱蒸汽流量對(duì)小龍蝦腐敗菌殺菌效果的影響

過熱蒸汽溫度為200 ℃，不同過熱蒸汽流量的殺菌過程中，蒸汽流量對(duì)4 種優(yōu)勢(shì)腐敗菌殺菌效果的變化趨勢(shì)與蒸汽溫度相似。其結(jié)果如圖4 所示，在殺菌初期，殘活率迅速減小。隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，腐敗菌的殘活率變化逐漸變緩慢。擬合不同蒸汽流量對(duì)小龍蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌的動(dòng)力學(xué)曲線都呈帶有“拖尾”的曲線。通過過熱蒸汽（19 m3/h，300 s；24 m3/h，250 s；29 m3/h，200 s）處理后，小龍蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌能被完全殺滅，其殺菌效果均能達(dá)到近100%的致死率。

圖3 在24 m3/h 蒸汽流量下殺菌處理小龍蝦產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌的存活曲線Fig.3 Survival curves of dominant spoilage bacteria from crayfish product after different 24 m3/h steam flow rate

圖4 在200℃蒸汽溫度下殺菌處理小龍蝦產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌的存活曲線Fig.4 Survival curves of dominant spoilage bacteria from crayfish product after different superheated steam flow rates,treatment time and 200 ℃ steam temperature

2.5 Weibull 模型參數(shù)及擬合評(píng)價(jià)

運(yùn)用Weibull 模型擬合不同過熱蒸汽溫度、流量和殺菌時(shí)間因素下殺滅4 株小龍蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌后殘活率的曲線。由表1 可知，Weibull 模型的R2≥0.935，表明Weibull 模型對(duì)過熱蒸汽滅活小龍蝦產(chǎn)品中優(yōu)勢(shì)腐敗菌的所有動(dòng)力學(xué)都具有較高擬合度。Weibul 模型因只有2 個(gè)參數(shù)b、n，具有一定的簡(jiǎn)潔性、靈活實(shí)用性，可避免過度參數(shù)化[32]。尺度參數(shù)b反映過熱蒸汽參數(shù)與殺菌效果間相關(guān)性，形狀參數(shù)n反映曲線的形狀。由表1 可知，參數(shù)b隨著過熱蒸汽溫度、流量的增大而增大，說明過熱蒸汽參數(shù)與殺菌效果呈正相關(guān)，所以提高過熱蒸汽溫度和增大流量，更容易到達(dá)滅活腐敗菌的效果；參數(shù)n的值均小于1（表1），表明擬合曲線的形狀為先迅速下降，后趨于平緩，呈凹形。因此，延長(zhǎng)殺菌時(shí)間并不能夠提高整個(gè)殺菌過程的殺菌效率[33]。為避免拖尾現(xiàn)象發(fā)生、提高過熱蒸汽殺菌效果和保障產(chǎn)品品質(zhì)，過熱蒸汽對(duì)小龍蝦腐敗菌的殺菌過程應(yīng)提高過熱蒸汽溫度、增大流量、縮短殺菌時(shí)間。

表1 Weibull 模型參數(shù)和R2Table 1 Weibull model parameters and R2

為衡量實(shí)際值與預(yù)測(cè)值的接近程度，以過熱蒸汽溫度、流量所有的實(shí)測(cè)值分別為橫坐標(biāo)，模型預(yù)測(cè)值為縱坐標(biāo)作圖，進(jìn)行線性擬合，其結(jié)果如圖5所示。實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值越接近，其關(guān)系曲線的斜率a、決定系數(shù)R2均接近于1，截距b接近于0。由圖5 可知，過熱蒸汽溫度和流量的線性回歸方程分別為y=0.984 11x-0.090 6（R2=0.984 98）、y=0.978 6x-0.127 73（R2=0.979 31）。斜率a、截距b分別為a=0.984 11、0.978 6；b=0.090 6、0.127 73。斜率a、R2均接近1，截距b接近于0，說明Weibull 模型得到的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值接近程度很高。

圖5 過熱蒸汽溫度和流量對(duì)小龍蝦腐敗菌殺菌效果的實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值的相關(guān)性Fig.5 Correlation between measured value and predicted value for inactivation effects of spoilage bacteria in crayfish by steam temperature and flow rate

2.6 殺菌機(jī)理初探

2.6.1 電導(dǎo)率及紫外吸收 細(xì)胞膜是維持細(xì)胞完整和細(xì)胞正常物質(zhì)運(yùn)輸、能量代謝的重要結(jié)構(gòu)，當(dāng)細(xì)菌的細(xì)胞膜受到破壞時(shí)，細(xì)胞膜失去控制物質(zhì)運(yùn)輸?shù)墓δ?，?xì)胞內(nèi)電解質(zhì)大量外流，導(dǎo)致菌懸液的電導(dǎo)率升高。同時(shí)膜內(nèi)小分子物質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)也隨之流出，這些核酸物質(zhì)在波長(zhǎng)260 nm 處有吸收[34]。因此通過測(cè)量菌懸液的電導(dǎo)率和260 nm吸光度的變化情況，了解菌體在過熱蒸汽處理后細(xì)胞膜的受損情況。從圖6-a 可知，0～ 40 s，菌懸液的電導(dǎo)率數(shù)值上升最快，40～ 250 s，菌懸液的電導(dǎo)率上升的速率比前40 s 緩慢。如圖6-b 所示，菌懸液在260 nm 的吸光度隨著過熱蒸汽處理時(shí)間延長(zhǎng)呈不斷上升趨勢(shì)，先快速升高后平緩增加。電導(dǎo)率與吸光度的變化表明在過熱蒸汽處理40 s后菌懸液中已有大量菌體的細(xì)胞膜受到破壞[35]。電導(dǎo)率和紫外吸收的變化規(guī)律與小龍蝦產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌的存活曲線（圖3、圖4）具有一致性。在殺菌初始階段，大量?jī)?yōu)勢(shì)腐敗菌被殺滅，隨著過熱蒸汽處理時(shí)間延長(zhǎng)，過熱蒸汽的殺菌速率變緩慢，最后趨于穩(wěn)定。

圖6 小龍蝦產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)腐敗菌電導(dǎo)率和紫外吸收隨過熱蒸汽處理時(shí)間的變化Fig.6 The changes of conductivity and UV absorption of the dominant spoilage bacteria from crayfish product treated with superheated steam treatment time

2.6.2 細(xì)菌微觀形態(tài)的觀察 圖7 表示小龍蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌蠟樣芽孢桿菌的微觀形態(tài)隨過熱蒸汽處理時(shí)間的變化。從圖7-A 觀察可知，未經(jīng)過熱蒸汽處理的細(xì)胞具有規(guī)則的長(zhǎng)桿狀，形態(tài)豐滿、完整、未變形，細(xì)胞表面光滑，無破裂，無內(nèi)容物外泄現(xiàn)象。過熱蒸汽處理40 s（圖7-B）后，菌體保持較完整的桿狀，但細(xì)胞表面變粗糙，出現(xiàn)不規(guī)則的褶皺，表現(xiàn)為凹凸不平，同時(shí)存在內(nèi)容物外泄現(xiàn)象，此時(shí)菌體形態(tài)已遭到破壞，細(xì)胞膜或細(xì)胞壁已破裂，導(dǎo)致菌懸液的電導(dǎo)率和紫外吸收數(shù)值的增加。過熱蒸汽處理150 s 和250 s 后（圖7-C 和圖7-D），菌體形態(tài)扭曲變形，菌體四周不完整，破損和斷裂嚴(yán)重，甚至有些菌體破裂成細(xì)胞碎片。結(jié)果表明，隨過熱蒸汽處理時(shí)間延長(zhǎng)，改變了菌株外部形態(tài)，并對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞壁膜造成不可逆的損傷，以及胞內(nèi)物質(zhì)外流，從而導(dǎo)致菌體死亡。

圖7 過熱蒸汽分別處理0、40、150、250 s 蠟樣芽孢桿菌的掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron microscopy of Bacillus cereus at different inactivation time with superheated steam

3 結(jié)論

采用稀釋涂布平板法，從腐敗的小龍蝦產(chǎn)品中分離出優(yōu)勢(shì)腐敗菌，經(jīng)重復(fù)劃線純化得到純菌落。根據(jù)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的16S rDNA 基因序列將其鑒定為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus macroides）。Weibull 模型能較好擬合過熱蒸汽溫度、流量和殺菌時(shí)間對(duì)熟制小龍蝦優(yōu)勢(shì)腐敗菌的滅活動(dòng)力學(xué)，其R2≥0.935。經(jīng)過熱蒸汽處理后，4 種小龍蝦產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)腐敗菌均能被完全殺滅。提高過熱蒸汽溫度和流量可以使過熱蒸汽對(duì)熟制小龍蝦腐敗菌的整體殺菌效果得到提升。同時(shí)通過對(duì)過熱蒸汽處理后菌懸液電導(dǎo)率和吸光度測(cè)量，以及對(duì)菌體微觀結(jié)構(gòu)的觀察，表明過熱蒸汽殺菌使菌體細(xì)胞膜遭到嚴(yán)重變化，使細(xì)菌形態(tài)發(fā)生變化，造成胞內(nèi)物質(zhì)外流，致使腐敗菌死亡。本研究結(jié)果證實(shí)過熱蒸汽是在小龍蝦產(chǎn)品加工殺菌過程中一種有前途的殺菌技術(shù)。