分化誘導(dǎo)因子-3對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖及趨電性的影響

軒轅玉潔， 呂媛， 趙三軍， 高潤(rùn)池

(云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650500)

分化誘導(dǎo)因子(Differentiation inducing factors，DIFs)最初是作為多細(xì)胞黏菌盤基網(wǎng)柄菌莖細(xì)胞分化的信號(hào)分子被鑒定出來，它們是一類可溶的擴(kuò)散性的親脂類烷基氯化物，主要由DIF-1及少量的DIF-2、DIF-3、DIF-4和DIF-5組成[1].研究發(fā)現(xiàn)，DIFs通過抑制哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)或促進(jìn)其分化來發(fā)揮抗腫瘤作用[2-9]，DIFs的抗腫瘤活力存在差異，其中DIF-3具有最強(qiáng)的抗腫瘤活力，此外，研究者們也合成了一些具有抗腫瘤活性的DIF衍生物[10].

目前，研究者對(duì)DIFs抗腫瘤機(jī)制的研究主要集中在調(diào)控細(xì)胞周期方面，例如，DIFs在腫瘤細(xì)胞中通過快速地增加細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度發(fā)揮作用[11]；DIFs直接抑制鈣調(diào)蛋白依賴的cAMP/cGMP磷酸激酶(PDE1)的活性和p-21激活的激酶1(PAK1)的活性[6]；DIF-3通過抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)降低細(xì)胞周期蛋白D1 mRNA的表達(dá)[9]；DIF-1和DIF-3通過激活GSK-3β來降低細(xì)胞周期蛋白D1的蛋白水平[7,9,12]；DIF-1通過抑制ERK和STAT2信號(hào)抑制細(xì)胞的增殖[5,8]；以及DIF-3通過調(diào)節(jié)ROS-依賴的DRP1-調(diào)節(jié)線粒體的分裂，引起細(xì)胞的自噬[13]等等.然而，DIFs抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制卻并不清楚.

腫瘤細(xì)胞不受控制地快速生長(zhǎng)導(dǎo)致其表面電荷發(fā)生明顯改變，從而在腫瘤增生區(qū)與周圍正常組織間存在電壓梯度，由此產(chǎn)生穩(wěn)定的直流電場(chǎng)，即腫瘤生物電場(chǎng)，且腫瘤組織的電流方向與周圍正常組織相反[14].腫瘤生物電場(chǎng)不僅具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞信號(hào)分子表達(dá)激活的作用，還能控制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移[15-17]，腫瘤細(xì)胞在生物電場(chǎng)中發(fā)生的定向遷移現(xiàn)象被稱為腫瘤細(xì)胞的趨電性，研究結(jié)果顯示腫瘤生物電場(chǎng)很可能與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移具有密切的關(guān)系.因此，本研究通過探討DIF-3對(duì)黑色素瘤細(xì)胞B16-F10趨電性的影響，試圖從腫瘤生物電場(chǎng)方面揭示DIF-3抗腫瘤的可能機(jī)制，為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供新思路.

1 材料與方法

1.1 材料

細(xì)胞株：小鼠皮膚黑色素瘤細(xì)胞株B16-F10購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù).

主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶及CO2非依賴性培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco公司；PBS緩沖液購(gòu)自Athena Es公司；DIF-1、DIF-3、Br-DIF-1和二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Sigma公司；青霉素/鏈霉素溶液購(gòu)自上海源培生物科技股份有限公司.

1.2 B16-F10細(xì)胞培養(yǎng)

B16-F10細(xì)胞培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃且5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.3 MTT法檢測(cè) B16-F10細(xì)胞的增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16-F10細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基(含10% FBS)重懸，將細(xì)胞濃度調(diào)至5×104個(gè)/mL，按每孔104個(gè)接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁12 h后，分別加入不同濃度(0、10 μmoL/L、20 μmoL/L和30 μmoL/L)的DIF-1、DIF-3和Br-DIF-1，每個(gè)濃度做6個(gè)重復(fù)，并在特定的時(shí)間(24 h和48 h)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞量.按以下公式計(jì)算B16-F10細(xì)胞的存活比率：

存活比率(%)=

實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DIF-3對(duì)B16-F10細(xì)胞遷移的影響

在12孔板中培養(yǎng)并進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，更換培養(yǎng)基以便除去懸浮細(xì)胞，拍照記錄0 h時(shí)的劃痕情況(記為scratch0).分別加入不同濃度(0、10 μmoL/L、20 μmoL/L和30 μmoL/L)的DIF-3，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，在37 ℃，5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，拍照記錄劃痕的情況(記為scratcht)，并用愈合率來表示細(xì)胞的遷移情況，具體計(jì)算公式如下：

劃痕愈合率=(1-scratcht/scratch0)×100%.

1.5 趨電性實(shí)驗(yàn)、圖像采集和數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 DIFs以濃度依賴方式抑制B16-F10細(xì)胞的增殖

為探究分化誘導(dǎo)因子或衍生物對(duì)黑色素瘤細(xì)胞B16-F10的抗增殖效果，實(shí)驗(yàn)選用DIF-1、DIF-3和Br-DIF-1三種分化誘導(dǎo)因子(或衍生物)分別處理細(xì)胞，并通過MTT法檢測(cè)不同濃度藥物處理后的細(xì)胞存活比率，從而反映藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用.結(jié)果如表1所示，DIF-1、DIF-3和Br-DIF-1都可以顯著降低細(xì)胞的存活比率，且隨著濃度增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，藥物對(duì)細(xì)胞的作用越強(qiáng),其中DIF-3的抑制效果最為明顯.

表1 不同種類分化誘導(dǎo)因子對(duì)B16-F10增殖的影響

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2 DIF-3以濃度依賴方式抑制B16-F10細(xì)胞的遷移

基于DIF-3對(duì)B16-F10細(xì)胞增殖具有顯著抑制效果，因此實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步選用DIF-3來研究分化誘導(dǎo)因子對(duì)B16-F10細(xì)胞遷移的影響.通過比較不同濃度的DIF-3(10 μmoL/L、20 μmoL/L和30 μmoL/L，以不加藥物為空白對(duì)照)處理后的劃痕面積變化情況來反映藥物對(duì)細(xì)胞遷移的影響.結(jié)果如圖1A所示，與空白對(duì)照相比，10 μmoL/L的DIF-3處理24 h就可以顯著抑制細(xì)胞的遷移，而且隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞遷移距離也逐漸降低，說明DIF-3不僅對(duì)B16-F10細(xì)胞的遷移有抑制作用，而且還以濃度依賴的方式發(fā)揮作用.

A.劃痕實(shí)驗(yàn)觀察圖 B.劃痕愈合率統(tǒng)計(jì)

2.3 DIF-3對(duì)B16-F10細(xì)胞趨電性的影響

在機(jī)體中腫瘤細(xì)胞的侵襲以集體遷移為主[20].為探究DIF-3對(duì)B16-F10細(xì)胞趨電性的影響，分別對(duì)單細(xì)胞、成片細(xì)胞和單層細(xì)胞進(jìn)行研究.實(shí)驗(yàn)都用20 μmoL/L DIF-3預(yù)處理單細(xì)胞、成片細(xì)胞和單層細(xì)胞，隨后施加2 V/cm的直流電場(chǎng)，實(shí)時(shí)錄像并分別對(duì)單細(xì)胞、成片細(xì)胞和單層細(xì)胞的趨電性運(yùn)動(dòng)情況進(jìn)行分析.結(jié)果如圖2(單細(xì)胞)、圖3(成片細(xì)胞)和圖4(單層細(xì)胞)所示，在直流電場(chǎng)刺激下，單細(xì)胞、成片細(xì)胞和單層細(xì)胞都具有明顯的朝向陰極的趨電性運(yùn)動(dòng)；用DIF-3處理細(xì)胞后，單細(xì)胞、成片細(xì)胞和單層細(xì)胞在直流電場(chǎng)中仍然朝向陰極運(yùn)動(dòng)，但是運(yùn)動(dòng)速度降低.

A.單細(xì)胞趨電軌跡圖;B.趨電性指標(biāo)統(tǒng)計(jì)圖

A.成片細(xì)胞趨電軌跡圖;B.趨電性指標(biāo)統(tǒng)計(jì)圖

圖420μmoL/LDIF-3對(duì)B16-F10單層細(xì)胞趨電性遷移的影響

Fig.4Effectof20μmoL/LDIF-3onthemonolayercellsgalvanotaxisofB16-F10

3 結(jié) 語

研究結(jié)果顯示，DIF-1、DIF-3和Br-DIF-1都可以抑制黑色素瘤細(xì)胞B16-F10的增殖，且以DIF-3的抑制效果最好，這與之前報(bào)道的結(jié)果一致[2,4,7].DIF-3處理后單細(xì)胞、成片細(xì)胞和單層細(xì)胞在電場(chǎng)中的遷移方向都沒有受到很大影響，但運(yùn)動(dòng)速度都不同程度地減小了,暗示DIFs的抗腫瘤機(jī)制有可能是通過腫瘤生物電場(chǎng)發(fā)生作用的，后期的研究將通過測(cè)定小鼠移植瘤周圍腫瘤生物電場(chǎng)的變化情況以及腫瘤發(fā)生發(fā)展情況來探討DIFs與腫瘤生物電場(chǎng)之間的具體關(guān)系.