妊娠期Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞相關(guān)分子與抗磷脂抗體表達(dá)及對妊娠結(jié)局的影響

崔佳 郭瑩 高偉 王霞 王娜 帖彥清

河北省人民醫(yī)院1檢驗科，3護(hù)理部抽血室，4老年病二科（石家莊050051）；2河北省秦皇島市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)科（河北秦皇島066000）

目前對于妊娠不良結(jié)局的引發(fā)機(jī)制尚不明確，認(rèn)為妊娠不良結(jié)局的發(fā)生與多種因素相關(guān)，且對于不良妊娠結(jié)局的認(rèn)識主要集中于血栓形成而導(dǎo)致的子宮胎盤堵塞病理生理原因研究中[1]。目前隨著生殖免疫學(xué)的發(fā)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)免疫因素可導(dǎo)致妊娠不良結(jié)局的產(chǎn)生，且發(fā)生不良妊娠結(jié)局的產(chǎn)婦大多伴隨著自身免疫失調(diào)[2]。研究[3-4]認(rèn)為由自身免疫反應(yīng)所引發(fā)的妊娠不良結(jié)局與抗磷脂抗體具有一定的相關(guān)性，目前抗磷脂抗體已經(jīng)成為自身免疫反應(yīng)研究的熱點。有學(xué)者認(rèn)為，妊娠期Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞相關(guān)分子的表達(dá)與妊娠合并疾病相關(guān)，但并無研究認(rèn)為其與妊娠不良結(jié)局有關(guān)，在本文研究中分析妊娠期Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞相關(guān)分子與抗磷脂抗體表達(dá)對妊娠結(jié)局的影響，以證實妊娠期Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞相關(guān)分子、抗磷脂抗體與妊娠結(jié)局的關(guān)系，為臨床上妊娠不良結(jié)局進(jìn)行預(yù)防和控制提供支持。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2014年1月至2017年12月河北省人民醫(yī)院就診的產(chǎn)婦作為研究對象，采用酶聯(lián)免疫吸附法對全部入組產(chǎn)婦測定血清抗心磷脂抗體IgA/G/M和抗β2糖蛋白I抗體IgA/G/M，將血清抗心磷脂抗體IgA/G/M陽性產(chǎn)婦作為對照組，共85例，將血清抗心磷脂抗體IgA/G/M和抗β2糖蛋白I（β2-GP1）抗體IgA/G/M同時陽性作為研究組，共86例。對照組所有產(chǎn)婦均為初產(chǎn)婦，年齡22～44歲，平均（32.12±10.32）歲，孕周6～16周，平均（11.22±5.01）周；觀察組所有產(chǎn)婦也均為初產(chǎn)婦，年齡22～43歲，平均（31.11±9.92）歲，孕周6～15周，平均（11.20±5.33）周，所有入組產(chǎn)婦年齡、孕期等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除生殖道畸形的產(chǎn)婦；排除患有內(nèi)分泌疾病的產(chǎn)婦；排除患有遺傳性疾病的產(chǎn)婦；排除患有精神障礙、溝通障礙的產(chǎn)婦。本次研究所有產(chǎn)婦及其家屬均知情，均簽署了知情同意書，且經(jīng)過我院倫理委員會批準(zhǔn)[倫理審批號：（2018）科研倫理審批第（107）號]。

1.2 方法

1.2.1 Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞相關(guān)分子相對表達(dá)量檢測取兩組產(chǎn)婦產(chǎn)前靜脈血3 mL將血漿分離出后在-80℃的環(huán)境下保存，使用Ficoll分離液將外周血單核細(xì)胞分離出，加入1 mL Trizol，在-80℃的環(huán)境下保存，提取RNA，之后對RNA純度、含量進(jìn)行檢測，使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA，之后使用Primer 5.0軟件對引物序列進(jìn)行設(shè)計，使用RT-PCR方法檢測產(chǎn)婦IL-33、ST2、GATA3 mRNA表達(dá)量，采用2-△△Ct方法計算出需要檢測的IL-33、ST2、GATA3 mRNA表達(dá)量。IL-33引物序列：上游：5′-TGACGGTGTTGATGGTAAGATG-3′，下游：5′-ACAGACTGTTCCTTGTTGTTGG-3′；ST2 引物序列：上游：5′-AGATGAGTCACTGGCATACG-3′，下游：5′-GAGAGGCTGGATGTTGTATT-3′；GATA3 引物序列：上游：5′-TTGTGGTGGTCTGTACAGTTC-3′，下游：5′-AGTACAGCTCCGGACTCTTC-3′；β-actin 引物序列：上游：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下 游 ：5′-CTAAGTTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。

1.2.2 妊娠不良結(jié)局統(tǒng)計對兩組產(chǎn)婦妊娠不良結(jié)局發(fā)生率進(jìn)行統(tǒng)計，包括習(xí)慣性流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、胎盤早剝等。

1.2.3 抗磷脂抗體滴度值檢測取兩組產(chǎn)婦產(chǎn)前靜脈血3 mL，在室溫環(huán)境下靜置30 min，之后使用離心，3 000 r/min離心15 min，分離上層血清，在溫度為-70℃的環(huán)境下保存。使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測產(chǎn)婦ACA-IgA、ACA-IgG、ACA-IgM、β2-GP1-IgA、β2-GP1-IgA、β2-GP1-IgM抗體，使用全自動酶標(biāo)儀定量檢測ACA-IgA、ACA-IgG、ACA-IgM、β2-GP1-IgA、β2-GP1-IgG、β2-GP1-IgM抗體滴度值，操作及結(jié)果判斷均按照試劑盒說明書進(jìn)行，ACA陽性標(biāo)準(zhǔn)為＞12 RU/mL，抗β2-GP1陽性標(biāo)準(zhǔn)為20 RU/mL。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析處理。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料比較采用百分率描述，兩組間比較采用χ2檢驗；相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組產(chǎn)婦Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞相關(guān)分子表達(dá)比較如表1所示，研究組產(chǎn)婦Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞相關(guān)分子IL-33 mRNA、ST2 mRNA、GATA3 mRNA相對表達(dá)量均低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 兩組產(chǎn)婦Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞相關(guān)分子相對表達(dá)量比較Tab.1 Relative expression of type II intrinsic lymphocyterelated molecules in two groups of parturients ±s

表1 兩組產(chǎn)婦Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞相關(guān)分子相對表達(dá)量比較Tab.1 Relative expression of type II intrinsic lymphocyterelated molecules in two groups of parturients ±s

例數(shù)85 86組別對照組研究組t值P值IL-33 mRNA 1.03±0.16 0.78±0.01 14.460 0.001 ST2 mRNA 1.02±0.15 0.86±0.03 6.698 0.001 GATA3 mRNA 0.76±0.12 0.35±0.06 28.310 0.001

2.2 兩組產(chǎn)婦妊娠結(jié)局比較如表2所示，研究組產(chǎn)婦總不良妊娠結(jié)局發(fā)生率顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 兩組產(chǎn)婦妊娠結(jié)局比較Tab.2 Comparison of pregnancy outcomes between two groups 例（%）

2.3 妊娠期Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞相關(guān)分子與抗磷脂抗體表達(dá)與不良妊娠結(jié)局的相關(guān)性分析妊娠期Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞相關(guān)分子與抗磷脂抗體表達(dá)與不良妊娠結(jié)局的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果如表3所示，IL-33與習(xí)慣性流產(chǎn)正相關(guān)，與早產(chǎn)、死胎、胎盤早剝無關(guān)；ST2與習(xí)慣性流產(chǎn)、死胎呈正相關(guān)，與早產(chǎn)、胎盤早剝無關(guān)；GATA3與習(xí)慣性流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、胎盤早剝均呈正相關(guān)；ACA-IgA、ACA-IgG、ACA-IgM與習(xí)慣性流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎盤早剝均呈現(xiàn)為正相關(guān)；β2-GP1-IgA、β2-GP1-IgG、β2-GP1-IgM抗體與習(xí)慣性流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、胎盤早剝均呈現(xiàn)為正相關(guān)。

3 討論

從生殖免疫學(xué)的觀點來看，妊娠的過程為一種特殊的機(jī)體免疫狀態(tài)，而妊娠不良結(jié)局的發(fā)生與機(jī)體免疫異常相關(guān)。

目前研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠不良結(jié)局發(fā)生后，母體帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)和血液中的蛋白質(zhì)復(fù)合后通過免疫機(jī)制產(chǎn)生抗磷脂抗體，在正常的情況下機(jī)體處于磷脂細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層保護(hù)中，母嬰界面處的磷脂不會被機(jī)體的免疫系統(tǒng)所識別[5-6]。目前臨床上已經(jīng)有病理學(xué)證據(jù)證實，抗心磷脂抗體在不良妊娠過程的發(fā)生中，會對前列環(huán)素的合成產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而增加胎盤微血栓形成的幾率；抗心磷脂抗體抑制抗凝血蛋白、抗凝血酶Ⅲ，進(jìn)而對凝血機(jī)制產(chǎn)生較為嚴(yán)重的破壞[7-8]。研究[9-11]認(rèn)為，抗磷脂抗體的實質(zhì)為與抗磷脂抗體相關(guān)一組抗體，其臨床表現(xiàn)為動靜脈血栓形成，進(jìn)而成為血栓形成特征的抗體綜合征?？沽字贵w屬于自身免疫性抗體組合，包括抗β2糖蛋白I抗體、抗心磷脂抗體、狼瘡樣抗凝物[12]。當(dāng)人體內(nèi)的抗磷脂抗體呈現(xiàn)為陽性后會發(fā)生動靜脈血栓，且此類動靜脈血栓的種類較多，包括視網(wǎng)膜血栓、深靜脈血栓、胎盤血栓、肺栓塞等[13-14]。另外WANG等[15]研究顯示，抗磷脂抗體會累及產(chǎn)婦子宮胎盤進(jìn)而導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)生長受限、子癇前期、流產(chǎn)以及胎盤早剝的發(fā)生?；谏鲜鲅芯浚诒疚难芯恐?，分析血清抗心磷脂抗體IgA/G/M和抗β2糖蛋白I抗體IgA/G/M陽性和血清抗心磷脂抗體IgA/G/M和抗β2糖蛋白I（β2-GP1）抗體IgA/G/M同時陽性產(chǎn)婦妊娠不良結(jié)局，結(jié)果顯示，抗心磷脂抗體IgA/G/M和抗β2糖蛋白I（β2-GP1）抗體IgA/G/M同時陽性產(chǎn)婦妊娠不良結(jié)局發(fā)生率較好，此結(jié)果說明抗磷脂抗體與產(chǎn)婦妊娠結(jié)局相關(guān)，與上述WANG等[15]研究結(jié)果保持一致。

表3 妊娠期Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞相關(guān)分子與抗磷脂抗體表達(dá)與不良妊娠結(jié)局的相關(guān)性分析Tab.3 Analysis of the relationship between expression of type II intrinsic lymphocyte-related molecules and anti-phospholipid antibody and adverse pregnancy outcomes±s

表3 妊娠期Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞相關(guān)分子與抗磷脂抗體表達(dá)與不良妊娠結(jié)局的相關(guān)性分析Tab.3 Analysis of the relationship between expression of type II intrinsic lymphocyte-related molecules and anti-phospholipid antibody and adverse pregnancy outcomes±s

相對表達(dá)量 早產(chǎn) 死胎IL-33 mRNA 0.67±0.12 ST2 mRNA 0.68±0.13 GATA3 mRNA 0.51±0.14 ACA-IgA 6.25±0.23 ACA-IgG 3.45±0.36 ACA-IgM 2.96±0.28 β2-GP1-IgA 23.98±3.86 β2-GP1-IgG 19.23±2.25 β2-GP1-IgM 20.12±3.15習(xí)慣性流產(chǎn)r=0.312 P=0.006 r=0.202 P=0.003 r=0.358 P=0.012 r=0.215 P=0.009 r=0.369 P=0.006 r=0.458 P=0.002 r=0.256 P=0.001 r=0.415 P=0.000 r=0.316 P=0.002 r=0.042 P=0.086 r=0.025 P=0.076 r=0.236 P=0.001 r=0.582 P=0.030 r=0.435 P=0.041 r=0.526 P=0.020 r=0.247 P=0.006 r=0.316 P=0.001 r=0.225 P=0.004 r=0.425 P=0.254 r=0.326 P=0.003 r=0.427 P=0.000 r=0.215 P=0.001 r=0.162 P=0.008 r=0.036 P=0.003 r=0.321 P=0.032 r=0.215 P=0.005 r=0.123 P=0.002胎盤早剝r=0.135 P=0.068 r=0.268 P=0.968 r=0.315 P=0.003 r=0.128 P=0.016 r=0.425 P=0.008 r=0.216 P=0.023 r=0.124 P=0.024 r=0.248 P=0.009 r=0.414 P=0.000

Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞在Th2所介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中具有重要的意義[16]。有研究[17]發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞相關(guān)因子GATA3與子癇前期有關(guān)，GATA3是一種在1991年HolC等所報道的轉(zhuǎn)錄因子，對Th2細(xì)胞分化具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，屬于一種Th分化所必需的轉(zhuǎn)錄因子，且其表達(dá)盡在Th2細(xì)胞中。IL-33屬于IL-1家族中較為重要的成員之一，可介導(dǎo)機(jī)體炎癥的發(fā)生[18]。目前臨床上有研究認(rèn)為，IL-33、ST2參與多種不良妊娠結(jié)局的發(fā)生，而ST2屬于IL-33的特異性受體[19]。在本文研究中，發(fā)現(xiàn)與單純抗心磷脂抗體IgA/G/M呈現(xiàn)為陽性的產(chǎn)婦相比，抗心磷脂抗體IgA/G/M和抗β2糖蛋白I抗體IgA/G/M同時呈現(xiàn)為陽性的產(chǎn)婦Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞相關(guān)分子IL-33 mRNA、ST2 mRNA、GATA3 mRNA相對表達(dá)量顯著降低，此結(jié)果說明，Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞相關(guān)分子與妊娠不良結(jié)局相關(guān)，與費倩倩等[20]研究中認(rèn)為IL-33與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)的結(jié)果保持一致。在本文研究中對Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞相關(guān)分子、抗磷脂抗體的表達(dá)與不良妊娠結(jié)局的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞相關(guān)分子IL-33、ST2、GATA3、ACA-IgA/G/M、β2-GP1-IgA/G/M與不良妊娠結(jié)局的發(fā)生有關(guān)。

綜上所述，妊娠期Ⅱ型固有淋巴細(xì)胞相關(guān)分子與抗磷脂抗體表達(dá)與妊娠不良結(jié)局具有一定的相關(guān)性，早期檢測IL-33、ST2、GATA3、ACA-IgA/G/M、β2-GP1-IgA/G/M可對妊娠不良結(jié)局進(jìn)行預(yù)防和控制。