葉酸誘導(dǎo)腎損傷的小鼠腎組織水通道蛋白表達(dá)隨病程遷延而減少

邢佳，黃宇穎，陳慧云，王愷悅，翟效月*

（1中國醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)系，2中國醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院，沈陽110122）

葉酸（folic acid, FA）誘導(dǎo)腎損傷模型目前被廣泛應(yīng)用于研究腎小管來源的急性（2d）轉(zhuǎn)慢性（14d）腎損傷與腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制。隨著FA晶體快速出現(xiàn)在腎小管中，其本身的直接細(xì)胞毒性及物理堵塞導(dǎo)致管狀上皮細(xì)胞損傷[1]。腎臟作為調(diào)節(jié)機(jī)體水平衡的主要器官，水通道蛋白(aquaporin,AQP)的主要成員AQP-1和AQP-2在上述腎損傷模型中的變化尚無報(bào)道。

正常腎臟中，AQP-1主要表達(dá)于近端小管、長髓襻降支細(xì)段的細(xì)胞膜游離面及側(cè)基底面，以及髓質(zhì)直小血管下降支內(nèi)皮細(xì)胞膜上，介導(dǎo)原尿中60%～80%水分的吸收[2-4]； 而AQP2主要表達(dá)于連接小管及集合管主細(xì)胞游離面細(xì)胞膜或胞質(zhì)內(nèi)囊泡[5,6]。在順鉑誘導(dǎo)的大鼠多尿模型中，AQP-1和AQP -2表達(dá)明顯降低[7]。但是，免疫組織化學(xué)技術(shù)顯示大多數(shù)病變腎臟的腎小球及腎小管上AQP-1表達(dá)上調(diào)[8,9]，這表明不同損傷導(dǎo)致腎損傷部位及病理改變不同。

在FA誘導(dǎo)急性轉(zhuǎn)慢性腎損傷模型中尚無相關(guān)研究。本研究通過檢測AQP-1和AQP-2在FA誘導(dǎo)腎損傷后2d、7d、14d的表達(dá)水平變化，探討AQP在FA腎損傷模型中的作用及對(duì)腎小管水重吸收的調(diào)節(jié)能力。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及FA誘導(dǎo)腎損傷模型的建立

C57BL/6雄性小鼠（6周齡）購買自遼寧長生生物，在標(biāo)準(zhǔn)SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)一周后造模。造模當(dāng)日上午8:00稱量體重。于11:00予以腹腔注射FA 250mg/kg（溶于0.3mmol/L NaHCO3）。小鼠飼養(yǎng)于（21±1）℃，濕度 50%±10%的環(huán)境，保持 12h 的明/暗光照周期，并提供充足的水和食物，分別于2d、7d、14d時(shí)在代謝籠中收集24h尿液，待麻醉后眼球取血，經(jīng)心臟灌流取腎臟，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各10只。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照世界醫(yī)學(xué)會(huì)倫理標(biāo)準(zhǔn)，并獲得中國醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 實(shí)驗(yàn)試劑

抗體：兔抗AQP1抗體（ab65837，Abcam，Cambridge，UK）、兔抗AQP2抗體（A7310，Sigma）；山羊抗兔（P450，DAKO，Glostrup，Denmark）；

試劑：葉酸（F7876，sigma）、牛血清白蛋白（A1933，Sigma）、DAB試劑盒（ZLI-9017，北京中杉金橋），糖原PAS染色試劑盒（G1281，索萊寶，中國）。

3 腎臟石蠟切片標(biāo)本制備

實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（2mg/kg）。麻醉后，通過心臟灌流4%多聚甲醛后取出腎臟，置于4%多聚甲醛連續(xù)固定48h，取出修塊，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟定向包埋，石蠟切片機(jī)（徠卡 RM2245, 德國）制備3～5μm切片。

4 PAS染色

將正常對(duì)照鼠、FA 2d、FA 7d、FA 14d小鼠腎臟石蠟切片置于二甲苯中脫蠟，高至低濃度乙醇水化，蒸餾水洗3次，每次5min。切片置于氧化劑（試劑A）中，室溫放置6min，后經(jīng)自來水洗2min，蒸餾水浸洗2次，暗室環(huán)境下置于Schiff Reagent（試劑B）浸染15min，自來水洗10min。置于蘇木素中染色液（試劑C）中1min，酸分化液中（試劑D）分化3s，自來水洗10min，使其返藍(lán)，逐級(jí)梯度增高乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

5 Masson染色

將正常對(duì)照鼠、FA 2d、FA 7d、FA 14d小鼠腎臟石蠟切片脫蠟、水化后，蒸餾水洗3次，每次5min。切片置于Masson麗春紅酸性復(fù)合染液中15min，0.2%醋酸浸洗3次。以5% 磷鎢酸溶液分化7min，0.2%醋酸洗3次，后經(jīng)甲苯胺藍(lán)染3min，0.2% 醋酸浸洗3次，逐級(jí)梯度增高乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

6 免疫組織化學(xué)染色檢測AQP-1和AQP-2表達(dá)特點(diǎn)

將正常對(duì)照鼠、FA 2d、FA 7d、FA 14d小鼠腎臟石蠟切片脫蠟、水化，PBS洗3次，每次5min。切片經(jīng)微波修復(fù)抗原（檸檬酸鹽修復(fù)液），常溫下PBS（3% BSA、0.05%皂苷、0.2%明膠、PH7.4）預(yù)孵育30min后，滴加AQP-1抗體（1:1500）和AQP-2抗體（1:1500），濕盒內(nèi)4℃過夜。室溫PBS洗3次，3% H2O210min封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS（0.1% BSA）洗3次，每次10min。隨后滴加山羊抗兔（1:200），常溫下孵育1h，PBS滴洗3次，每次10min。蒸餾水洗5min，DAB顯色1～3min，蘇木素復(fù)染25s后1%鹽酸酒精分化3s，流水沖洗20min返藍(lán)，經(jīng)梯度乙醇和二甲苯脫水、透明、中性樹脂封片。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，最終在顯微鏡（Nikon90i，日本）下采集圖像。

結(jié) 果

1 FA誘導(dǎo)腎損傷模型鼠的腎組織結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞及其變化特點(diǎn)

PAS和Masson染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組刷狀緣及基底膜均為紫紅色染色，代表糖原或糖蛋白沉著（圖1A）。與正常對(duì)照組相比，F(xiàn)A 2d的腎皮質(zhì)及外髓外帶近端小管受損嚴(yán)重，表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)紊亂、細(xì)胞腫脹并呈現(xiàn)水變性及空泡變性，崩解的細(xì)胞碎屑與刷狀緣脫落于管腔（圖1B）。相較于FA 2d和FA 7d皮質(zhì)小管結(jié)構(gòu)恢復(fù)至接近正常，小管上皮較正常組薄，管腔擴(kuò)大，管周間隙增大，胞質(zhì)少，且胞質(zhì)及核均濃染（圖1C）。FA 14d皮質(zhì)淺層及中層小管普遍擴(kuò)張，近端小管結(jié)構(gòu)再次紊亂，與FA 2d相似，而髓放線中遠(yuǎn)端及集合管結(jié)構(gòu)排列整齊，類似于FA 7d恢復(fù)中的近端小管，即管腔擴(kuò)張、管壁變薄，胞質(zhì)及核深染（圖1D）；此時(shí)，PAS陽性的小管基底膜增厚，而Masson染色顯示管周間隙中纖維成分有沉積，呈藍(lán)色（圖1D）。

圖1 PAS及Masson染色顯示腎臟組織結(jié)構(gòu)。A，正常對(duì)照組PAS染色，插入框?yàn)閷?duì)應(yīng)Masson染色局部圖；B，F(xiàn)A 2d PAS染色；C，F(xiàn)A 7d PAS染色；D，F(xiàn)A 14d PAS染色，插入框?yàn)镸asson染色局部圖；星號(hào)，近端小管；雙黑箭頭，刷狀緣脫落；單黑箭頭，基底膜間斷性斷裂；白箭頭，上皮細(xì)胞水變性和空泡變性；無尾黑箭頭，增寬的管周間隙；比例尺，25μmFig. 1 Renal microstructure of normal and FA induced renal injury mice with PAS and Masson staining. A, PAS staining of control group, insert box corresponding to local Masson staining figure; B, PAS staining of FA 2d; C, PAS staining of FA 7d; D, PAS staining of FA 14d, insert box corresponding to local Masson staining figure；asterisk, proximal tubule; double black arrows, deciduous brush border; single black arrow, discontinuous rupture of basement membrane; white arrow, hydropic and vacuolar degeneration in the epithelial cells; tailless black arrow, widened interstitium between tubules;scale bar, 25μm

2 FA誘導(dǎo)腎損傷模型鼠腎的AQP-1和AQP-2表達(dá)變化規(guī)律

正常小鼠中，AQP-1表達(dá)于近端小管的腔面和側(cè)基底面及髓襻降支細(xì)段，在皮髓質(zhì)中，廣泛分布于微動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞膜表面，包括髓質(zhì)中的直小血管下降支（圖2A1）；而AQP-2則表達(dá)于皮質(zhì)中的連接小管及貫穿皮髓質(zhì)走行的集合管主細(xì)胞表面（圖2A2）。

圖2 正常及FA誘導(dǎo)腎損傷模型鼠腎的AQP-1和-2免疫組織化學(xué)染色。A1和A2，分別為正常對(duì)照鼠腎AQP-1和-2表達(dá)； B1，C1和D1，分別為FA 2d、FA 7d、FA 14d AQP-1表達(dá)；B2，C2和D2，分別為FA 2d、FA 7d、FA 14d AQP2表達(dá)；黑箭頭，損傷嚴(yán)重近端小管和集合管細(xì)胞幾乎不表達(dá)AQP-1和AQP-2；白箭頭，AQP-2在集合管頂部的胞質(zhì)部分表達(dá)明顯增多；比例尺，25μmFig. 2 Immunostaining of AQP-1 and AQP-2 in the kidney of FA induced renal injury mice and normal mice. A1 and A2, immunohistochemical staining of AQP-1 and AQP-2 in control normal mice, respectively; B1, C1 and D1, immunohistochemical staining of AQP-1 in the kidney of FA induced renal injury mice on FA 2d、FA 7d、FA 14d, respectively; B2, C2 and D2, immunohistochemical staining of AQP-2 in the kidney of FA induced renal injury mice on FA 2d、FA 7d and FA 14d, respectively; black arrow, almost nonexistent of AQP1 and AQP-2 in seriously damaged proximal tubule and collecting tubule cells; white arrow, AQP-2 was signi ficantly increased in cytoplasmic portion at the apical part of the collecting duct principal cells; scale

FA 2d時(shí)，皮質(zhì)及外髓外帶結(jié)構(gòu)紊亂的近端小管上皮細(xì)胞仍然表達(dá)AQP-1，但空泡變性嚴(yán)重的細(xì)胞則無AQP-1表達(dá)。內(nèi)髓直小血管及髓襻降支細(xì)段的AQP-1表達(dá)不受影響，甚至呈現(xiàn)增強(qiáng)。此時(shí)，AQP-2在集合管主細(xì)胞上的表達(dá)未受明顯累及，幾無變化（圖2 B1與B2）。

相較于FA 2d和FA 7d皮質(zhì)的小管損傷較之前減輕，AQP-1僅弱表達(dá)在結(jié)構(gòu)相對(duì)較好的近端小管腔面，包括外髓外帶；但基底側(cè)面陽性更弱。此時(shí)，AQP-2在集合管從皮質(zhì)到髓質(zhì)都呈強(qiáng)陽性。

FA 14d時(shí)，皮質(zhì)及外髓小管結(jié)構(gòu)再度紊亂；與FA 2d相比，此時(shí)腎組織間質(zhì)細(xì)胞成分增加，小管管壁變薄，以至于很難區(qū)分小管節(jié)段。整個(gè)皮髓質(zhì)AQP-1僅在少量殘存的上皮細(xì)胞呈弱陽性表達(dá)。此時(shí)，集合管較FA 7d時(shí)顯著擴(kuò)張，AQP-2在主細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)，且在頂部的胞質(zhì)部分明顯增多。

討 論

葉酸誘導(dǎo)腎損傷模型目前被廣泛用于研究急性腎損傷及慢性間質(zhì)纖維化，盡管其與碳酸氫鈉混合使用可堿化尿液而減少結(jié)晶形成導(dǎo)致的小管堵塞，但其本身的直接毒性及結(jié)晶導(dǎo)致的小管堵塞仍使管狀上皮細(xì)胞受到損傷[10,11]，因此，F(xiàn)A常被用于研究以腎小管毒性損傷為主要來源的急性（FA 2d）轉(zhuǎn)慢性（FA 14d）腎損傷的模型，而且FA誘導(dǎo)劑量高低與腎損傷程度密切相關(guān)。

本研究中，F(xiàn)A 2d時(shí)出現(xiàn)腎小管結(jié)構(gòu)紊亂，尤其以近端小管為嚴(yán)重，出現(xiàn)大量水變性甚至空泡變性的上皮細(xì)胞，而集合管未受到明顯累及，提示腎臟損傷處于急性期[12]。此時(shí)，近端小管仍然表達(dá)AQP-1，且由于細(xì)胞塌陷，其表達(dá)可能會(huì)表現(xiàn)得較強(qiáng)，但部分管腔已經(jīng)被崩解的上皮細(xì)胞填塞，加之細(xì)胞呈現(xiàn)變性改變，功能會(huì)削弱，臨床上仍會(huì)表現(xiàn)為少尿。當(dāng)腎小球?yàn)V過液在近端小管未能被重吸收時(shí)，細(xì)段和直小血管下降支為適應(yīng)損傷，維持正常尿液的濃縮功能，反而增強(qiáng)了AQP-1的表達(dá)。

FA 7d時(shí)，腎組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)到接近正常，近端小管變性壞死的細(xì)胞較FA 2d減少。此時(shí)，近端小管結(jié)構(gòu)雖然完整，但是胞質(zhì)少，故上皮變薄，胞質(zhì)及核濃染，AQP-1弱陽性表達(dá)，提示小管正經(jīng)歷自我修復(fù)。此外，與正常結(jié)構(gòu)不同的是，管周間隙擴(kuò)大，可能與急性損傷期部分塌陷的小管無法修復(fù)導(dǎo)致腎單位萎縮或丟失有關(guān)。

FA 14d時(shí)，AQP-1在近端小管的表達(dá)持續(xù)減少，髓質(zhì)的表達(dá)雖增強(qiáng)但陽性小管數(shù)目卻減少，此時(shí)，集合管主細(xì)胞受到累及，集合管較FA 7d擴(kuò)張，少量細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，此時(shí)AQP-2不僅表達(dá)在主細(xì)胞細(xì)胞膜，在頂部的胞質(zhì)部分也明顯增多，這可能是因?yàn)锳QP2在細(xì)胞內(nèi)囊泡表達(dá)升高，以適應(yīng)損傷。然而，即使幸存的小管細(xì)胞再生修復(fù)，但潴留的FA仍持續(xù)損傷小管，且部分損傷小管上皮細(xì)胞可能轉(zhuǎn)分化形成肌成纖維細(xì)胞，分泌細(xì)胞外基質(zhì)。因此，Masson染色可見沉積的膠原纖維，提示損傷的腎可能已經(jīng)形成纖維化[12,13,14]，進(jìn)一步加重了近端小管、降支細(xì)段和集合管損傷，此時(shí)，AQP-1和AQP-2的表達(dá)均明顯減少。

綜上所述，F(xiàn)A誘導(dǎo)腎損傷模型中，近端小管損傷較集合管早，急性損傷后壞死的上皮細(xì)胞不再表達(dá)AQP-1，殘存的近端小管及降支細(xì)段的上皮細(xì)胞通過增強(qiáng)AQP-1表達(dá)以適應(yīng)損傷，在形態(tài)學(xué)上也觀察到腎臟在FA 7d有短暫的修復(fù)期。然而，持續(xù)的損傷導(dǎo)致腎臟修復(fù)不良，集合小管也受累，AQP-2代償性的在殘存集合小管細(xì)胞內(nèi)囊泡的表達(dá)升高。表明AQPs參與了腎小管來源的急性（FA 2d）轉(zhuǎn)慢性（FA 14d）腎損傷的發(fā)病機(jī)制，這為深入研究腎損傷的水平衡能力提供了新的途徑。