Hippo信號(hào)通路在腫瘤免疫中的作用

陳慶，朱安平，李正平，王媛，殷焦*，沈關(guān)心

（1中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第991醫(yī)院 441010；2湖北文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院 襄陽(yáng) 441053；3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系 武漢，430030）

Hippo通路最早在果蠅研究中被發(fā)現(xiàn)，主要通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡，進(jìn)而控制組織器官生長(zhǎng)體積的大小。Hippo通路相關(guān)的信號(hào)分子亦參與免疫應(yīng)答反應(yīng)，在哺乳動(dòng)物中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用等。近年研究發(fā)現(xiàn)Hippo信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，成為新的研究熱點(diǎn)。Hippo通路在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮至關(guān)重要作用，推測(cè)其功能障礙可能是腫瘤發(fā)生的初始因素之一。本文就Hippo通路相關(guān)信號(hào)分子在腫瘤免疫中的作用進(jìn)行綜述，旨在深入了解Hippo通路的重要功能，為其作為臨床研究抗腫瘤的潛在靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 保守的Hippo信號(hào)通路

Hippo通路是組織器官體積大小的保守信號(hào)通路，同時(shí)還可以調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、控制組織器官體積大小，以及干細(xì)胞的自我更新等[1,2]。

在果蠅研究中鑒定的Hippo通路有4個(gè)主要激酶 成 分：Hippo（Hpo）、Salvador（Sav）、Warts（Wts）和Mob腫瘤抑制因子（Mats）；其中任何一個(gè)成分失活都會(huì)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和抑制凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限制增殖。Hpo-Sav形成復(fù)合體通過(guò)磷酸化Wts-Mats復(fù)合體而激活腫瘤抑制通路，有效控制細(xì)胞的增殖。果蠅體內(nèi)Hippo通路的核心是Yorkie （Yki）蛋白，Yki激活后會(huì)發(fā)生Hpo/Sav-Wts/Mats軸失去效應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞的大規(guī)模增殖[3]；Hpo-sav誘導(dǎo)的Wts磷酸化，繼而引起Yki磷酸化，磷酸化Yki增加，滯留在細(xì)胞質(zhì)而無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核，使細(xì)胞分裂增殖被抑制。

在哺乳動(dòng)物，Hippo通路每個(gè)激酶成分對(duì)應(yīng)的信號(hào)分子分別是：MST1/2對(duì)應(yīng)Hpo，SAV1對(duì)應(yīng)Sav，LATS1/2對(duì)應(yīng)Wts，MOB1對(duì)應(yīng)Mats，Hippo信號(hào)通路由這4個(gè)主要的激酶調(diào)控Yes相關(guān)蛋白 （Yes-associated protein, Yap）及其旁系同源蛋白TAZ的活性。Yap和TAZ在哺乳動(dòng)物為腫瘤蛋白，與果蠅的Yki是同源蛋白。

當(dāng)Hippo通路激活后引起Mst 1/2 活化，與支架蛋白Savl組成復(fù)合物使Lats1/2 （large tumor suppressor ; LATS）激酶磷酸化并被激活，與另一支架蛋白Mob1組成復(fù)合物，直接使Yap蛋白上S127被磷酸化后產(chǎn)生一個(gè)14-3-3的結(jié)合基序，與胞漿中的14-3-3蛋白結(jié)合而滯留在胞漿中，或進(jìn)一步被磷酸化后通過(guò)蛋白酶體途徑被降解[3]。

非磷酸化狀態(tài)的Yap進(jìn)入細(xì)胞核后，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，發(fā)揮其生物學(xué)作用。目前公認(rèn)的轉(zhuǎn)錄因子是TEA-domain （TEAD）和p73。核內(nèi)Yap/TAZ與TEAD結(jié)合，促進(jìn)或抑制TEAD靶基因的表達(dá)，如CTGF（connective tissue growth factor，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子）和Cyr61（cysteine-rich protein 61, 富半胱氨酸肝素結(jié)合蛋白61），調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能。例如，發(fā)生細(xì)胞接觸抑制，即當(dāng)細(xì)胞密集接觸時(shí)，Hippo通路活化，Yap/TAZ磷酸化水平增加、與細(xì)胞核隔離，其細(xì)胞增殖作用消失；細(xì)胞分離時(shí)，Hippo通路失活、促進(jìn)Yap/TAZ遷移至細(xì)胞核引導(dǎo)細(xì)胞的分裂增殖[4]。Yap/TAZ 是Hippo通路主要的轉(zhuǎn)錄輔激活因子，其在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間的位置轉(zhuǎn)移決定Hippo是否被有效激活。

2 Hippo-Yap信號(hào)通路與腫瘤免疫

炎癥反應(yīng)的微環(huán)境誘導(dǎo)發(fā)生有害的突變，使機(jī)體發(fā)生各類腫瘤的機(jī)率大大增加。微環(huán)境中的免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間一直都在發(fā)生相互作用。

研究報(bào)道[5]在多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)核內(nèi)Yap的表達(dá)增高，Yap的活性與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，腫瘤發(fā)生的每個(gè)階段都有過(guò)量Yap激活，因此Yap被確定為腫瘤蛋白，與Hippo-Yap通路功能障礙相關(guān)所發(fā)生的腫瘤稱為Yap依賴的腫瘤（Yap-independent cancer）。Hippo通過(guò)調(diào)控下游蛋白Yap的表達(dá)影響腫瘤發(fā)生與發(fā)展。體外實(shí)驗(yàn)報(bào)道Hippo信號(hào)通路功能失調(diào)的肝細(xì)胞會(huì)發(fā)展成惡性腫瘤。

2.1 Hippo-Yap通路與TIC募集巨噬細(xì)胞相關(guān)

腫瘤發(fā)生最初階段是以單個(gè)腫瘤啟動(dòng)細(xì)胞（tumor-initiating cell,TIC）存在的時(shí)期，活化狀態(tài)的Yap有助于TIC募集巨噬細(xì)胞保護(hù)腫瘤細(xì)胞、使之免于免疫清除。

正常情況下，TIC微環(huán)境中的炎性細(xì)胞因子以及IFN等促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟、活化以及抗原交叉呈遞，擴(kuò)大并活化效應(yīng)性CD8＋T細(xì)胞克隆，從而確保免疫監(jiān)視及免疫清除。最近研究[6]發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞MST1/2缺失會(huì)引起相關(guān)的Yap過(guò)表達(dá)，直接并顯著增強(qiáng)肝細(xì)胞分泌單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein，MCP-1），促進(jìn)巨噬細(xì)胞大量浸潤(rùn)（圖1a），M1和M2表型混雜。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證明，轉(zhuǎn)基因表達(dá)過(guò)量Yap蛋白，沉默MST1/2或敲除SAV1的小鼠發(fā)生肝臟腫大，并最終致肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）發(fā)生發(fā)展。Yap的去除可抑制MST1/2-dko小鼠MCP1表達(dá)，恢復(fù)正常的肝臟生長(zhǎng)。MCP1是肝細(xì)胞中Yap的直接轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，在人肝癌中Yap靶點(diǎn)和MCP-1之間存在強(qiáng)基因表達(dá)相關(guān)性；肝細(xì)胞中的Hippo信號(hào)通過(guò)抑制Yap依賴的MCP1表達(dá)，抑制腫瘤前微環(huán)境形成過(guò)程中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，維持正常的肝臟生長(zhǎng)抑制HCC增殖，為治療肝癌提供了新的靶點(diǎn)[6]。

趙斌課題組研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞中Yap的激活誘導(dǎo)集落刺激因子1（colony stimulating Factor，CSF-1）和C-C Motif趨化因子配體2（C-C Motif Chemokine Ligand 2，CCL2）兩個(gè)趨化因子的表達(dá)，招募M2型巨噬細(xì)胞至TIC周圍（圖1b），抑制效應(yīng)T細(xì)胞，促使TIC逃逸免疫監(jiān)視，避免被清除[7]。因此盡管炎癥局部微環(huán)境中發(fā)生著免疫反應(yīng)，對(duì)于癌細(xì)胞卻依然如“培養(yǎng)基”般使之“茁壯成長(zhǎng)”。Hippo通路的激活抑制Yap-TEAD復(fù)合物形成，抑制TIC相關(guān)巨噬細(xì)胞的招募，減少釋放對(duì)TIC有保護(hù)作用的分子，有助于腫瘤殺傷細(xì)胞更加有效的發(fā)揮作用。這項(xiàng)研究首次證明巨噬細(xì)胞在體內(nèi)單個(gè)TIC的存活中起著決定性作用并為通過(guò)靶向Yap或巨噬細(xì)胞消除TIC提供了原理證明。

Treg細(xì)胞的聚集也在TIC的微環(huán)境中介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。研究發(fā)現(xiàn)胃腺癌中Hippo通路成分Lats2、Yap的表達(dá)與浸潤(rùn)性Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)以及腫瘤Foxp3的表達(dá)正相關(guān)。Hippo通路通過(guò)磷酸化Yap，減少浸潤(rùn)性Treg細(xì)胞數(shù)量并降低其活性，有助于機(jī)體的抗腫瘤免疫，抑制TIC增殖[8]。

2.2 Hippo通路與MDSCs相關(guān)

腫瘤細(xì)胞最初成功的免疫逃逸導(dǎo)致腫瘤的繼續(xù)發(fā)展，與此同時(shí)機(jī)體針對(duì)腫瘤組織發(fā)生免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)；一部分細(xì)胞發(fā)揮監(jiān)視并清除突變細(xì)胞的功能，另一部分以髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）為代表的免疫細(xì)胞則促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受反應(yīng)。在有關(guān)前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)抑制Hippo通路，Yap-TEAD復(fù)合物形成增加，進(jìn)而上調(diào)MDSCs的趨化因子CXCL5的分泌[9]，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞微環(huán)境中表達(dá)趨化因子受體CXCR2的MDSCs的募集，抑制免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的清除（圖1c）。Murakami等隨后在胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）小鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，且與臨床中觀察到的PDAC數(shù)據(jù)一致[10]。Sarkar等在高分化漿液性卵巢癌小鼠模型研究中還發(fā)現(xiàn)Yap作用于腫瘤基因PRKCI，進(jìn)而上調(diào)腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor ，TNF-α）的表達(dá)，募集MDSCs，抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T cell，CTL）功能[11]。

2.3 Hippo信號(hào)通路與PD-L1相關(guān)

從單個(gè)TIC的形成到發(fā)展為惡性腫瘤的整個(gè)過(guò)程中，Hippo信號(hào)通路的抑制有助于腫瘤從宿主免疫監(jiān)測(cè)中逃逸，特別是在Yap相關(guān)的腫瘤發(fā)生中。參與調(diào)節(jié)免疫監(jiān)測(cè)的重要分子程序死亡配體1（programmed death ligand，PD-L1），與PD-1的相互作用誘導(dǎo)并維持T細(xì)胞耐受，延長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞的存活（圖1d）。

在非小細(xì)胞肺癌的研究[12]提示Hippo-Yap信號(hào)與PD-L1密切相關(guān)，細(xì)胞核內(nèi)Yap-TEAD復(fù)合物的形成促進(jìn)腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)，進(jìn)而可導(dǎo)致免疫監(jiān)控系統(tǒng)對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的失能。在腫瘤組織中Yap和PD-L1表達(dá)顯著相關(guān)，表達(dá)高水平PD-L1細(xì)胞系中，磷酸化Yap/Yap的比率低，抑制Yap可降低PDL1的mRNA和蛋白水平；Yap基因的強(qiáng)制過(guò)度表達(dá)提高PD-L1的mRNA和蛋白質(zhì)水平。染色質(zhì)免疫沉淀（CHIP）分析使用Yap特異性單克隆抗體導(dǎo)致PD-L1增強(qiáng)子區(qū)域的沉淀，包括兩個(gè)假定的TEAD結(jié)合位點(diǎn)。

在人乳腺癌和肺癌細(xì)胞系體外模型研究中均證實(shí)TAZ和PD-L1蛋白水平的相關(guān)性，表明Hippo通路效應(yīng)因子YAP和TAZ直接上調(diào)PD-L1的表達(dá)，抑制抗腫瘤T細(xì)胞免疫反應(yīng)[13]。CHIP和熒光素酶檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TAZ/YAP/TEAD復(fù)合物增強(qiáng)PD-L1 啟動(dòng)子活性，共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明其在腫瘤細(xì)胞免疫逃逸中的具有重要意義。Lee等認(rèn)為[14]Yap是人類肺腺癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子；表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）的耐藥與Yap、PD-L1表達(dá)具有相關(guān)性；Yap敲除的腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平降低；上游調(diào)節(jié)因子（PI3K、RAF）和Hippo通路中的信號(hào)分子（MST1/2, LATS1/2）也可調(diào)控PD-L1的表達(dá)。Hippo信號(hào)可能通過(guò)調(diào)控PDL1的表達(dá)參與免疫逃避。但這種調(diào)節(jié)機(jī)制尚未在小鼠細(xì)胞系模型中發(fā)現(xiàn)。

Feng等研究證實(shí)Hippo信號(hào)在人類肺腺癌中的表達(dá)受細(xì)胞外環(huán)境pH值的影響，進(jìn)而導(dǎo)致TAZ介導(dǎo)的PD-L1上調(diào)。在腫瘤乳酸水平和PD-L1表達(dá)相關(guān)性研究模型中，G蛋白偶聯(lián)受體 81 （G-protein-coupled receptors, GPR81）通過(guò)細(xì)胞內(nèi)cAMP的耗竭啟動(dòng)乳酸誘導(dǎo)的PD-L1上調(diào)水平，抑制蛋白激酶A（protein kinase A, PKA），激活Yap/TAZ； Hippo信號(hào)通過(guò)PD-L1介導(dǎo)局部免疫抑制,重塑腫瘤微環(huán)境；Yap/TAZ抑制腫瘤細(xì)胞外圍的適應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)；腫瘤細(xì)胞可能通過(guò)局部微環(huán)境中物理、生化刺激Hippo信號(hào)調(diào)控PD-L1表達(dá)以逃避免疫清除[15]。

3 Hippo信號(hào)通路中Yap磷酸化存在的爭(zhēng)議

Hippo信號(hào)通路發(fā)揮效應(yīng)的核心歸因于Yap磷酸化，磷酸化的Yap決定Hippo信號(hào)是否激活或失效。其他激酶也可調(diào)節(jié)磷酸化Yap水平和活性。如胞漿中Yap 在S127上磷酸化后使之滯留在細(xì)胞質(zhì)，或進(jìn)一步被酪蛋白激酶1（casein kinase 1，CK1）磷酸化、并通過(guò)蛋白酶體使其降解；在S381上磷酸化會(huì)導(dǎo)致Yap的降解；在Y357上磷酸化可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但在Yes1上的磷酸化會(huì)誘導(dǎo)抗凋亡作用[16,17]。細(xì)胞所處環(huán)境以及磷酸化的位點(diǎn)不同而產(chǎn)生不同效應(yīng)[18]，因此Hippo-Yap信號(hào)通路在某些情況下表現(xiàn)出雙重性。

圖1 Hippo通路與腫瘤免疫。a，dKO MST1/2誘導(dǎo)Yap依賴的MCP1過(guò)表達(dá)，促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞聚集；b，單個(gè)腫瘤細(xì)胞調(diào)節(jié)Hippo通路并激活Yap，表達(dá)細(xì)胞因子并招募II型巨噬細(xì)胞，抑制T細(xì)胞免疫清除； c，活化的Yap提高了Cxcl5水平，促進(jìn)MDSCs招募和T細(xì)胞抑制；d，Yap通過(guò)促進(jìn)PD-L1的表達(dá)使腫瘤細(xì)胞逃避宿主免疫監(jiān)視，抑制細(xì)胞免疫Fig. 1 Hippo pathway is involved in tumor immunology. A, dKO MST1/2 induced the Yap-dependent MCP1 overexpression and promoted the aggregation of tumor-related macrophages; b, a the tumor cell can modulate Hippo pathway to activate Yap, and thus express certain cytokines and recruit type II macrophages, which prohibit immune clearance of T cells; c, activated YAP raises Cxc15 level, so MDSCs are recruited and T cells are suppressed;d, Yap promotes the expression of PD-L1 to enable tumor cells to evade host immune surveillance and suppress cellular immunity

對(duì)于非Yap依賴的腫瘤研究發(fā)現(xiàn)，有研究證明Yap可抵消主導(dǎo)腸組織自我更新和再生的信號(hào)通路Wnt/β-catenin通路的促腸組織的再生的作用[2]；在淋巴瘤、骨髓瘤等惡性血液病中Yap通過(guò)與p53的同源基因p73相互作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[19]。除了Yap，Hippo信號(hào)通路的上游成員LATS1/2也表現(xiàn)為兩方面的作用[20]：LATS1/2磷酸化Yap，促進(jìn)其細(xì)胞質(zhì)隔離以及限制細(xì)胞增殖；但LATS1/2失活會(huì)促發(fā)針對(duì)自身細(xì)胞的免疫反應(yīng)，進(jìn)而破壞LATS1/2沉默的相應(yīng)細(xì)胞，維持個(gè)體的免疫穩(wěn)態(tài)。

Moroishi等人提出Hippo通路的分子LATS1/2缺失引發(fā)抗腫瘤反應(yīng)[20]：盡管LATS1/2作為Hippo通路中Yap的上游信號(hào)分子，通過(guò)磷酸化Yap防止核易位，但其敲除后引發(fā)的抗癌反應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于激活Yap引發(fā)的促生長(zhǎng)效應(yīng)。LATS1/2敲除的細(xì)胞在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出更強(qiáng)的增殖能力，表明細(xì)胞生長(zhǎng)的最初并不依賴于Yap過(guò)表達(dá)或Hippo通路功能障礙。LATS1/2敲除的腫瘤細(xì)胞通過(guò)分泌更多富含核酸的細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs），進(jìn)而激活Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）。下游涉及TLRs的內(nèi)源性核酸通路被激活，進(jìn)而激活免疫應(yīng)答，這項(xiàng)研究證明LATS1/2敲除的細(xì)胞引導(dǎo)機(jī)體發(fā)生更強(qiáng)大的免疫反應(yīng)消滅自身。

4 展望

綜上所述，越來(lái)越多Hippo通路相關(guān)的分子機(jī)制的發(fā)現(xiàn)拓寬了研究視野，復(fù)雜的微環(huán)境可能導(dǎo)致Hippo通路作用的多重性，Hippo通路的調(diào)節(jié)處于動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的過(guò)程，以調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡的平衡，以及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定；Hippo信號(hào)在不同的環(huán)境中發(fā)揮不同效應(yīng)，其詳盡機(jī)制仍有待探討。近年來(lái)其相關(guān)抗癌治療的藥物，例如以Yap為治療靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物的開發(fā)還處于初級(jí)階段，其應(yīng)用前景正逐步在擴(kuò)大；若聯(lián)合通過(guò)阻斷T細(xì)胞活化共抑制信息分子（co-inhibitory molecules）的癌癥監(jiān)測(cè)點(diǎn)阻斷（immune checkpoint blockade）免疫治療，或可成為影響癌癥的策略和手段。全面揭示Hippo-Yap信號(hào)通路精確的分子調(diào)控機(jī)制，為臨床抗腫瘤治療研究尋求潛在靶點(diǎn)，為精準(zhǔn)治療藥物的研發(fā)提供廣闊的思路。