食源性金黃色葡萄球菌腸毒素基因及其表達檢測

張 婧 張 易 施春雷

（上海交通大學農(nóng)業(yè)與生物學院 中美食品安全聯(lián)合研究中心 上海 200240）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種具有較強攻擊性的常見人類病原菌，隸屬于葡萄球菌屬，可引起多種醫(yī)院感染和社區(qū)感染性疾病，輕者引起化膿性皮膚感染，嚴重時甚至導致各種危及生命的并發(fā)癥，如菌血癥和心內(nèi)膜炎[1]。金黃色葡萄球菌在環(huán)境中分布廣泛，對外界不利環(huán)境如干燥、低溫等有較強的抵抗能力，極易通過各種途徑污染食品，會引發(fā)金黃色葡萄球菌食物中毒（S.aureus food poisoning，SFP），對食品安全和人類健康造成重大威脅。當金黃色葡萄球菌污染食品后，會在適宜的環(huán)境條件下大量繁殖，與此同時分泌各種毒素或毒力因子，如金黃色葡萄球菌腸毒素（Staphylococcal enterotoxins，SE），大大增加了其侵襲性和致病力。消費者食用了被金黃色葡萄球菌污染的食品后便會引起SFP[2]，主要的中毒癥狀為腹瀉、惡心、嘔吐等，中毒嚴重者還會出現(xiàn)胃腸痙攣，體內(nèi)水平衡失調(diào)甚至虛脫，脫水等癥狀[3]。根據(jù)美國疾病預防控制中心的研究報道[4]，每年在美國由金黃色葡萄球菌導致的食物中毒約有24萬人次，其中1 000多人需要住院治療并約10人因此死亡，由該菌引起的食物中毒占整個細菌性食物中毒的33%；在加拿大，這個比例高達45%[5]。我國每年也會發(fā)生多起該類食品安全事件，給醫(yī)療衛(wèi)生造成巨大壓力。

據(jù)報道，由5種傳統(tǒng)腸毒素SEA～SEE引起的金黃色葡萄球菌食物中毒占比高達95%[6]。來自許多不同國家和地區(qū)的研究顯示，SEA是引起金黃色葡萄球菌食物中毒事件的最主要的腸毒素[7]。不同的金黃色葡萄球菌菌株會分泌不同類型的腸毒素，即使分泌同一種腸毒素，其產(chǎn)生量往往也會因生長環(huán)境不同而有差異[8]。鑒于腸毒素的多樣性和多變性，以及其產(chǎn)生的普遍性，由腸毒素導致的金黃色葡萄球菌食物中毒在治療和防御上都有很大難度，因此一直以來都是食源性污染監(jiān)測的重點對象。本研究對比不同菌株、不同腸毒素基因的攜帶及其表達情況，有助于進一步分析腸毒素表達的環(huán)境條件，加強產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌的防范和控制，同時可為食品安全監(jiān)控和風險評估提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

1）金黃色葡萄球菌食源性分離株：33株金黃色葡萄球菌食源性分離株，分離自2014年9月至2015年5月采集的上海市市售食品樣品。分離和鑒定方法按照 《金黃色葡萄球菌檢驗方法》（GB4789.10-2010）第一法對采集的樣品中污染的金黃色葡萄球菌進行選擇性分離，對疑似菌株用PCR技術擴增nuc1基因對其做進一步鑒定[9]。

2）腸毒素陽性對照菌株：ATCC8095（攜帶sea、sed基因）；ATCC14458（攜帶seb基因）；ATCC27664（攜帶see基因）；I073（攜帶sec基因），均為本實驗室保藏。

1.1.2 主要設備與儀器 Mastercycler型全自動PCR擴增儀、5810 R型高速微量臺式離心機、Thermomixer comfort型恒溫混勻器，德國Eppendorf；EPS 2A 200型電泳儀，美國Harvard Hoefer；GIS2020型紫外凝膠成像系統(tǒng)，上海天能；ES-315型滅菌鍋，日本TOMY；Mili-Q超純水系統(tǒng)，美國Mili-Q；HZ-8211K型恒溫搖床，太倉科教儀器；HPP 260型恒溫培養(yǎng)箱，德國Memmert；CA-1480-2型垂直層流潔凈工作臺，上海上凈；Forma 900 Series型-80℃超低溫冰箱，美國Thermo Fisher。

1.1.3 主要試劑

1）TE 緩沖液：10mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）；1 mmol/L EDTA（pH 8.0）；121℃滅菌15min，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2）引物（上海生工）開蓋前先12 000 r/min離心30 s，按使用說明加入一定量的TE緩沖液溶解，使其終濃度為100mmol/L，-20℃保存?zhèn)溆?，使用時以無菌純水稀釋10倍至終濃度10mmol/L。

3）混合溶菌酶溶液：用TE緩沖溶液溶解溶菌酶（Lysozyme，美國Sigma 62970）和溶葡萄球菌酶（Lysostaphin，美國Sigma L7386），配制成質(zhì)量濃度為20mg/mL溶菌酶、5mg/mL溶葡球菌酶的混合酶溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4）TIAN amp細菌基因組DNA提取試劑盒（上海天根）。

5） Taq DNA 聚合酶、dNTP、PCR buffer（大連寶生物）。

6）3MTMTecraTM微孔板法葡萄球菌腸毒素ID快速檢測試劑盒（3M中國有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的活化 從-80℃超低溫冰箱中取出金黃色葡萄球菌食源性分離株和腸毒素陽性標準菌株的甘油保藏管，在超凈臺內(nèi)用移液槍吸取10 μL金黃色葡萄球菌甘油保藏液接種到TSB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過夜后，在超凈臺內(nèi)用金黃色葡萄球菌菌液劃平板，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 h，長出單菌落的平板放入4℃冰箱，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA的提取 從TSB平板上挑取單菌落至TSB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過夜后，按照DNA提取試劑盒的說明，提取金黃色葡萄球菌食源性分離株和標準菌株的基因組DNA。

1.2.3 金黃色葡萄球菌腸毒素基因的PCR篩查 根據(jù)已有的文獻報道和檢索GenBank數(shù)據(jù)庫，設計合成了5種金黃色葡萄球菌腸毒素基因的引物序列，具體見表1。

表1 金黃色葡萄球菌5種腸毒素基因引物序列及其產(chǎn)物大小Table1 Primer sequences and fragment size of products of 5 enterotoxin genes

以提取的基因組DNA作為模板，PCR擴增5種金黃色葡萄球菌腸毒素基因，按比例配制反應體系：10× buffer 2.5μL，MgCl2溶液（25mmol/L）1.5 μL，dNTPs（各 2.5 mmol/L）1 μL，上下游引物（10 μmol/L）0.5 μL＋0.5 μL，Taq DNA 聚合酶（1 U/μL）0.5 μL，DNA 模板 2.0 μL，無菌水 16.5 μL。擴增條件：95℃預變性 5min，95℃變性 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。

吸取5μL PCR擴增產(chǎn)物，與1μL 10×Loading Buffer混勻后，將100 bp DNA Ladder和樣品點樣于1.5%瓊脂糖凝膠（內(nèi)含萬分之一核酸染料DuRed），電壓 120 V，電泳時間 45min，電泳結束后使用紫外凝膠成像系統(tǒng)成像并觀察結果。

1.2.4 金黃色葡萄球菌腸毒素表達的篩查 本研究使用3MTMTecraTM微孔板法葡萄球菌腸毒素ID快速檢測試劑盒進行腸毒素表達的篩查，大致試驗步驟如下。

1）樣品液的制備：5mL過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌菌液加10mL Tris緩沖液，充分混合。3 000 r/min離心10min。用注射器過濾裝置過濾菌液后，調(diào)節(jié)pH值至7～8。取1mL過濾液與50 μL樣品添加液，充分混合備用。

為對比環(huán)境條件對腸毒素表達的影響，本研究中分別使用了TSB培養(yǎng)液和食品基質(zhì)（牛奶）培養(yǎng)得到金黃色葡萄球菌菌液進行相關檢測。

2）參考試劑盒說明書配制試劑，包括洗液（Wash solution）、結合物（Conjugate）、底物（Substrate）、終止液和樣品添加劑（Stop solution，Sample additive）、陽性毒素對照液（Positive control）及陰性食品對照（Negative control）的準備。

圖1 5種金黃色葡萄球菌腸毒素基因的凝膠電泳圖Fig.1 Electrophoresis of 5 S.aureus enterotoxin genes

3）參考試劑盒說明書進行孔板試劑盒的操作，確保使用前試劑盒內(nèi)所有試劑處于室溫（20～25℃）。

4）判讀結果：結果可用比色卡直接肉眼判讀。使用比色卡注意陽性對照必須至少達到比色卡4號顏色，并且陰性對照顏色必須淺于比色卡2號顏色，此時試驗結果有效。

微孔變色說明存在腸毒素，攜帶腸毒素基因的菌株能夠有效表達。

2 結果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌腸毒素基因攜帶情況

攜帶這5種腸毒素基因的金黃色葡萄球菌標準菌株的電泳圖如圖1所示。

使用表1所示的5種金黃色葡萄球菌腸毒素基因的引物，對33株食源性分離株進行毒力基因篩查，得到了這些分離株中5種傳統(tǒng)腸毒素基因的攜帶率，具體結果見圖2。5種腸毒素基因中檢出率最高的基因是seb，總攜帶率為48.48%（16/33），攜帶率最低的腸毒素是see，僅為9.09%（3/33）。其它3種腸毒素基因的攜帶率依次為是sec 30.30%（10/33）、sea 27.27%（9/33）和sed 15.15%（5/33）。

33株分離株中，腸毒素基因的檢出率為100%，即每株分離株至少攜帶一種腸毒素基因，且有2株分離株（SJTUF21507、21509）同時攜帶有3種腸毒素基因，而有6株分離株同時攜帶有2種腸毒素基因。

圖2 5種腸毒素基因在33株食源性分離株中的攜帶率Fig.2 Carrying rate of 5 enterotoxin genes in 33 foodborne S.aureus isolates

2.2 金黃色葡萄球菌腸毒素分泌情況

通過3MTMTecraTM微孔板法檢測，有21株分離株出現(xiàn)腸毒素陽性結果，即腸毒素基因得到了有效表達，其具體試驗結果見圖3。在本試驗中，經(jīng)TSB培養(yǎng)基或食品基質(zhì)（牛奶）培養(yǎng)后的金黃色葡萄球菌，其中5種腸毒素的表達情況一致。

圖3 33株食源性分離株中5種腸毒素基因的攜帶和表達Fig.3 The carrying and expression of 5 enterotoxin genes in 33 foodborne S.aureus isolates

3 討論

SE是由金黃色葡萄球菌所產(chǎn)生的一類典型的超抗原組成，它的N端肽鏈具有催吐活性，可引起人嘔吐，是導致SFP的罪魁禍首[14]。SE引起的食物中毒占整個細菌性食物中毒的首位，而其中，傳統(tǒng)腸毒素SEA～SEE是引起該類食物中毒最主要的因素，其表達與否，直接影響著菌株的致病性。SE蛋白具有顯著的耐熱性和耐酸性。一旦食物受到SE污染，常規(guī)的烹煮甚至高溫處理并不能使其完全變性失活，而仍然保有超抗原活性，繼而引起嘔吐和胃腸炎等食物中毒癥狀。此外，SE蛋白耐胃腸蛋白酶滅活，包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和凝乳酶[15]，因此可以很容易進入人體腸道中產(chǎn)生毒素。

在本試驗中，PCR對5種傳統(tǒng)腸毒素基因的篩查結果顯示，腸毒素基因的檢出率高達100%，證明其存在具有普遍性。其中，seb和sec的攜帶率較高，都超過30%，最低see的攜帶率不超過10%。值得一提的是，雖然33株食源性分離株均攜帶至少一種腸毒素基因，但是在3MTMTecraTM微孔板法檢測的結果中，只有63.64%（21/33）的菌株腸毒素檢測結果呈陽性，即有腸毒素表達。雖然有數(shù)據(jù)表示，不同的培養(yǎng)基質(zhì)對SEs的產(chǎn)生也有一定影響，例如2013年Valihrach等[16]的研究證明，所有受測菌株在牛奶中產(chǎn)生的SEC均少于在微生物肉湯中的量。而本試驗僅定性地證明了受測的33株食源性分離菌在TSB和牛奶中的SE產(chǎn)生情況一致，但產(chǎn)生的數(shù)量是否一致，還需要進一步檢測。

SE基因在金黃色葡萄球菌中的表達由多個調(diào)控元件（例如：agr、arlRS和saeRS）和DNA 結合蛋白（例如：sarA家族和sigB因子）協(xié)調(diào)[17]。此外，pH值、溫度、氧氣、碳源、鹽、金屬離子和短肽等環(huán)境信號可能對毒力基因的轉錄有影響[18]。SE產(chǎn)生的環(huán)境整體范圍較廣，在溫度10～45℃，pH 4.5～9.6，水分活度Aw 0.85～0.99 以上，NaCl質(zhì)量分數(shù)介于0～10%的條件下均可產(chǎn)生[19]。含淀粉、蛋白質(zhì)和水分較多的食品，如牛乳及乳制品、肉和蛋等，都可以為其產(chǎn)生提供適宜的食品基質(zhì)。不同SE的產(chǎn)生也存在一定規(guī)律性和差異性。例如，SEA產(chǎn)生的pH范圍較廣，一般要求大于4.5，Aw＞0.86，這也是SEA在過去報道中，引起金黃色葡萄球菌食物中毒最多的主要原因。相比之下，SEB和SEC產(chǎn)生的pH范圍較窄，均為中性，且只有在Aw＞0.96且溫度適宜的情況下，SEB才能分泌產(chǎn)生[3]。綜合而言，SE產(chǎn)生的最適溫度為37℃，當存放在20℃以上時，溫度越高，產(chǎn)生腸毒素時間越短；在通風不良，氧氣壓較低的時候，更容易形成SE[20-21]。所以，即使攜帶了SE基因，也不一定能夠得到表達產(chǎn)生SE蛋白，這與本試驗的結果相一致。

一般來說，SE引起食物中毒所需的劑量極少，有研究表明[15]，SEA的最低催吐劑量可達0.5 ng/mL。目前，一般的監(jiān)管規(guī)定只要求對日常食品中是否存在5種傳統(tǒng)腸毒素SEA～SEE進行檢測，這也是5種腸毒素與食物中毒關系研究較多的原因。然而，截至目前，共有22種SE基因被發(fā)現(xiàn)，分別是sea～see、seg～sev、sey[22]。且據(jù)已有報道顯示，在不少引起SFP的分離菌株中，只攜帶某些新型SE。這也就意味著，未來對SFP的預防和治療過程中，也需要關注新型SE。

4 結論

金黃色葡萄球菌攜帶SE基因并不一定就會表達產(chǎn)生相應的SE蛋白，還需要多系統(tǒng)的協(xié)調(diào)及適宜的環(huán)境條件。在未來研究中，可以加強對SE產(chǎn)生與環(huán)境因素之間關系的探究，從而通過調(diào)節(jié)環(huán)境因素來抑制金黃色葡萄球菌增殖，及其腸毒素分泌提供更多數(shù)據(jù)支持。