精準醫(yī)學時代對免疫組化的新認識①

危曉莉 彭慧琴 徐恩萍

(浙江大學基礎醫(yī)學院,杭州 310058)

21世紀以來，醫(yī)學技術不斷發(fā)展，醫(yī)療水平明顯改善?；蚪M學技術、蛋白質組學技術、生物芯片技術、納米生物技術、生物醫(yī)學大數(shù)據(jù)等新技術的發(fā)展與應用，改變了傳統(tǒng)醫(yī)學診療模式，正逐步進入以精準醫(yī)學、個性化醫(yī)療為特征的新醫(yī)學時代。

2011年11月，美國國家科學研究委員會發(fā)布愿景性報告《邁向精準醫(yī)療》，首次正式提出“精準醫(yī)療”概念，將其定義為“一種與個體分子病理學特征相匹配的診斷和治理策略”，替代個體化醫(yī)療，作為新時期整合基礎研究、轉化研究、臨床研究和醫(yī)學實踐的框架，強調(diào)將分子病理學作為精準醫(yī)療的基礎[1]。曹雪濤院士對精準醫(yī)學的定義是：通過基因組學、蛋白質組學等組學技術和醫(yī)學前沿技術，對大樣本人群與特定疾病類型進行生物標志物的分析、鑒定、驗證與應用，精確尋找病因和治療靶點，并對一種疾病不同狀態(tài)和過程進行精確亞分類，實現(xiàn)對疾病和特定患者的精確診斷及個性化治療，提高疾病效益[2]。精準醫(yī)學的目標是精準治療、個性化治療，以精準診斷為前提，而精準診斷需依托于精準的檢測結果。臨床病理診斷是診斷的金標準，病理醫(yī)生除常規(guī)病理形態(tài)學診斷外，還需評估疾病的易感性及發(fā)病風險，協(xié)助制定個性化治療方案，判斷預后，因此需要病理醫(yī)生不斷學習新知識新技術，整合檢查結果，以病理科精準的檢測結果作為支撐[3]。

如何提高病理檢測的精準度一直是病理技術的重點。分子病理學是精準醫(yī)療技術手段，免疫組化在抗原檢測方面具有諸多優(yōu)勢，是新醫(yī)學時代病理檢測的重要技術手段之一，如浸潤性乳腺癌靶向治療基于免疫組化結果和基因型分析進行分型，腫瘤分子治療靶點檢測是基于免疫組化結果的檢測，如CTLA-4、PD-1/PD-L1等。精準醫(yī)學時代應從新視角、新高度重新審視免疫組化技術，不斷提高其精準度，為精準診斷、精準醫(yī)療保駕護航。高精準度的檢測技術具有3個特征：①定量；②重復性、穩(wěn)定性、可比性好；③自動化、標準。本研究將從以上3個特征探討免疫組化的精準度。

1 免疫組化的定量檢測

免疫組化是應用抗原與抗體特異性結合原理，通過標記抗體的(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色情況對組織與細胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質)，對其進行定位、定性及相對定量研究。免疫組化本質是定性檢測方法，但可通過直接陽性細胞計數(shù)、百分比計數(shù)、評分等進行半定量檢測?？山梃bELISA檢測原理，設定封閉程序系統(tǒng)，應用標準化試劑、標準化對照(肽、蛋白、人造組織)，通過擬合曲線計算抗原含量[4]。因此，免疫組化定量是一個龐大的系統(tǒng)工程，尚有很多技術難點需攻克。但是檢測方法的“好”、“壞”不能單純用能否定量判斷，免疫組化在診斷、預測、預后判斷方面毫不遜色于其他定量檢測方法，前提是適當、有效、正確地用于適合的檢測[5]。

2 免疫組化技術的重復性、穩(wěn)定性、可比性

免疫組化技術的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、可靠性較差，嚴重降低其作為診斷參考指標的可信度，因此，免疫組化技術的標準化是病理技術工作的重點和難點，需要提高其重現(xiàn)性，提高臨床病理診斷的“含金量”[6]。

1977年，美國首屆國家癌癥研究所重點討論免疫組化技術標準化議題[7]。我國最早于1996年召開了全國免疫組織化學技術與診斷標準化專題研討會，全國病理技術學組和病理質控中心也就免疫組化標準化做出重大嘗試[8]。為滿足臨床病理診斷、治療要求，對免疫組化實驗操作、病理診斷過程的具體程序步驟進行規(guī)范，從事免疫組化相關活動的實驗室需嚴格遵照執(zhí)行，包括免疫組化切片制作標準化和免疫組化診斷標準化[9]。

切片制作標準化是免疫組化結果準確性的重要保障，已有部分操作標準或行內(nèi)共識，但尚存不足，短期內(nèi)化還不能做到如ELISA一樣精確，但可提高其重復性及穩(wěn)定性。對檢測者進行專業(yè)技能培訓與資格認證，建立良好的室內(nèi)、室間質量控制體系必不可少，對照設置尤為重要，是免疫組化結果敏感性、特異性、可靠性、重復性、可比性的重要保障。陽性對照的設置是檢測敏感性的保證，2015年國際特設專家委員會對免疫組化陽性對照標準化問題進行了探討，推薦18種病理診斷常用抗體對照組織及其染色結果判斷標準[10,11]。陰性對照的設置是檢測特異性的保證，陰性組織對照與陰性試劑對照同等重要，可防止非特異性染色。作為最終檢測結果指導臨床治療時，每個患者、每個檢測指標都應設置陰性試劑對照，以確保其特異性[12]。

免疫組化診斷標準化即病理醫(yī)生的主觀判斷必須依據(jù)相應判斷標準，每個檢測指標制定相應的診斷標準，診斷報告按照標準化格式，描述對內(nèi)對照、陽性對照、陰性對照的表達情況[13,14]。病理醫(yī)生要通過檢測判讀者前后對照和判讀者間對照，做好質量控制，確保結果準確。

3 免疫組化技術的自動化、標準化、信息化

傳統(tǒng)免疫組化技術操作是開放系統(tǒng)，易受人為因素影響，導致檢測結果可控性、穩(wěn)定性、一致性差。自動免疫組化染色儀各流程步驟標準化，可保證結果可靠、穩(wěn)定，是未來發(fā)展的必然趨勢。最新的免疫組化染色儀可個性化設置單張切片，靈活性較大，可同批次制作同一患者切片，縮短臨床病理診斷周期[14]。

將免疫組化切片圖像轉變?yōu)樘摂M切片，即全切片 圖像(whole slide images,WSI)，不僅有利于圖像信息的保存和傳輸，且在此基礎上已開發(fā)多個自動圖像分析功能，部分已應用于臨床。深度學習是當前最接近人工智能的機器學習方法，應用于病理圖像分析是目前研究方向，已在細胞層面上的檢測分割、組織層面上的分類和癌癥的分級等方面初步應用，將人工智能、深度學習應用于免疫組化技術的分析診斷指日可待[15]。

精準醫(yī)學時代免疫組化技術仍是病理學主要技術之一，但要求更高的重復性、穩(wěn)定性、精準性，在輔助精準診斷、精準治療、治療預測、預后判斷方面發(fā)揮重要作用，隨著數(shù)字技術、信息技術、人工智能技術等的飛速發(fā)展，免疫組化技術將會有跨越性發(fā)展。