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    對蝦病害防控的理論與實踐

    2020-01-16 01:45:30王寶杰蔣克勇
    海洋科學(xué) 2020年7期
    關(guān)鍵詞:弧菌對蝦胰腺

    劉 梅, 王寶杰, 蔣克勇, 王 雷

    (中國科學(xué)院海洋研究所實驗海洋生物學(xué)重點實驗室, 山東 青島 266071)

    從2001年至今我國對蝦的年產(chǎn)量一直穩(wěn)居世界首位, 2017年達到 134.5萬噸[1], 其中凡納對蝦(Penaeus vannamei)是目前我國對蝦養(yǎng)殖的主導(dǎo)品種。2018年9月, 全球第二大市場研究機構(gòu)Markets and Markets發(fā)布“對水產(chǎn)養(yǎng)殖品市場全球預(yù)測”報告顯示, 2018年我國的對蝦消費為全球第一, 達到200萬噸。我國對蝦市場需求未來將保持較高增速,存在巨大的供需缺口, 市場發(fā)展前景廣闊。

    雖然對蝦產(chǎn)量持續(xù)增長, 但是病害一直是影響我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要問題。據(jù)統(tǒng)計, 自1990年代初以來, 由于疾病造成的損失約為每年 10億美元[2]。層出不窮的病害導(dǎo)致對蝦養(yǎng)殖業(yè)成為既高回報又高風(fēng)險的行業(yè)。筆者所在研究團隊多年來立足于我國對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的實際需求, 以對蝦抗病反應(yīng)機理的探究為基礎(chǔ), 分析對蝦應(yīng)對病原微生物、真菌毒素以及環(huán)境脅迫的反應(yīng)機理。同時注重研究成果的轉(zhuǎn)化, 開發(fā)了系列化安全投入品, 并積極推動對蝦養(yǎng)殖模式的轉(zhuǎn)型升級。

    1 對蝦機體免疫機理研究

    根據(jù)目前的研究結(jié)果顯示, 對蝦養(yǎng)殖業(yè)危害最嚴重的病原主要為細菌和病毒。危害對蝦養(yǎng)殖的病毒主要包括白斑綜合征病毒(White Spot Syndrome Virus, WSSV), 黃頭病毒(Yellow Head Virus, YHV)和桃拉病毒(Taura Syndrome Virus, TSV)等。其中WSSV是最危險的致病性病毒之一, 可導(dǎo)致對蝦90%~100%的死亡率[2]。近年來, 隨著無特定病原SPF(Specific Pathogen Free)蝦苗的推廣應(yīng)用, 病毒性病害對對蝦養(yǎng)殖業(yè)的危害逐漸減弱, 蝦肝腸胞蟲(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)、致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticuscausing AHPND,VpAHPND)成為對蝦養(yǎng)殖的主要病害, 而由養(yǎng)殖環(huán)境富營養(yǎng)化導(dǎo)致的肝胰腺壞死癥和白便綜合征等也成為了影響對蝦產(chǎn)量的重要因素。針對病害種類不斷變化的對蝦養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)狀, 近年來研究團隊立足于對蝦自身的免疫反應(yīng)機制, 探討了對蝦應(yīng)對病原微生物、霉菌毒素以及環(huán)境脅迫等不同類型外界因素的反應(yīng)機制, 為對蝦病害的防控積累了豐富的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

    1.1 對蝦應(yīng)對病原微生物的免疫反應(yīng)機理

    弧菌一直被認為是很多無脊椎動物特別是蝦的主要致病菌。高密度對蝦養(yǎng)殖導(dǎo)致養(yǎng)殖水環(huán)境惡化,進而由弧菌引發(fā)對蝦養(yǎng)殖病害, 特別是近年來致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌(VpAHPND)的危害日益嚴重, 對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。為深入探究弧菌的感染機理, 基于 Cox比例風(fēng)險模型, 探究了哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)不同菌株、劑量及感染方式對凡納對蝦的攻毒效果的影響, 從而為有效控制弧菌攻毒試驗的風(fēng)險因素提供指導(dǎo)[3-4]。在此基礎(chǔ)上, 通過一系列弧菌攻毒實驗, 探討了對蝦腸道和肝胰腺對致病性副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)的響應(yīng)機制。分析發(fā)現(xiàn)凡納對蝦感染副溶血弧菌后, 細胞凋亡相關(guān)基因和抗病相關(guān)基因如抗菌肽等的表達水平升高, 肝胰腺抗氧化酶類基因表達發(fā)生顯著變化, 而生長代謝相關(guān)信號通路受到抑制[5]。利用轉(zhuǎn)錄組測序(RNAseq)技術(shù)及生物信息學(xué)分析, 探究腸道黏膜屏障在凡納對蝦抵御副溶血弧菌感染中的作用。通過對差異表達的基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)的分析, 發(fā)現(xiàn)凡納對蝦腸道黏膜中對副溶血弧菌攻毒做出反應(yīng)的基因涉及到腸道黏膜的免疫屏障、化學(xué)屏障和機械屏障的相關(guān)功能。組織切片和透射電鏡觀察副溶血弧菌感染后的對蝦腸道組織細胞結(jié)構(gòu)變化, 可見腸道上皮組織發(fā)生細胞連接破壞、細胞核固縮、溶酶體和凋亡小體出現(xiàn)等明顯變化。表明腸道黏膜副溶血弧菌感染后發(fā)生了機械、化學(xué)及免疫功能的改變, 上述生理反應(yīng)在凡納對蝦腸道抵御弧菌感染的過程中發(fā)揮重要作用[6-7]。

    1.2 對蝦應(yīng)對真菌毒素-黃曲霉毒素的反應(yīng)機理

    飼料和原料中黃曲霉毒素 AFB1污染導(dǎo)致養(yǎng)殖動物攝食率降低、代謝紊亂、飼料轉(zhuǎn)化效率降低以及對病害的抵抗力降低, 成為危害對蝦養(yǎng)殖的重要因素。肝胰腺和腸道是對蝦主要的消化、營養(yǎng)和代謝器官, 在其生長和免疫方面具有非常重要的作用。為了研究凡納對蝦應(yīng)對 AFB1的響應(yīng)機制, 近年來分別針對不同劑量黃曲霉毒素對凡納對蝦的損傷機理進行了深入的探討, 以期在此基礎(chǔ)上發(fā)掘相應(yīng)的解決方案。

    首先, 采用高劑量黃曲霉毒素 B1(15 mg/kg)飼喂對蝦8 d, 分析其腸道和肝胰腺的反應(yīng)機制。通過對肝胰腺轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn), 差異表達基因(DEGs)有1 024個, 其中上調(diào)的基因153個, 下調(diào)的基因 871個。涉及的生命過程主要包括基礎(chǔ)代謝過程、大分子代謝過程、凋亡、細胞內(nèi)吞、細胞黏附和細胞連接等。黃曲霉毒素攝入導(dǎo)致對蝦肝胰腺出現(xiàn) R細胞數(shù)量減少、上皮層與肌皮層分離、核固縮, 細胞裂解和壞死等顯微結(jié)構(gòu)的改變以及抗氧化酶活性的顯著升高[8-9]。上述結(jié)果表明高劑量短時間的黃曲霉毒素刺激對肝胰腺的代謝過程造成損傷,調(diào)控生長代謝過程的信號通路被抑制, 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被抑制, 細胞凋亡通路被激活, 肝胰腺抗氧化酶系統(tǒng)激活用于清除過量的活性氧(ROS)。分析高劑量黃曲霉毒素對凡納對蝦腸道的損傷發(fā)現(xiàn), AFB1顯著抑制了生長代謝調(diào)控通路 mTOR通路, 刺激了免疫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Dorsal和Relish以及黏蛋白樣圍食膜因子(mucin-like PM)等基因的表達。AFB1攝入也破壞了凡納對蝦腸道組織形態(tài)。顯示高劑量 AFB1不僅影響腸道黏膜的結(jié)構(gòu), 而且損傷了腸道的免疫屏障和化學(xué)屏障[7,10]。

    為更好地了解對蝦對長期攝入黃曲霉毒素的反應(yīng)機制, 進行了較低劑量黃曲霉毒素的攻毒實驗。發(fā)現(xiàn)投喂較低劑量黃曲霉毒素 AFB1(5 mg/kg)的飼料30 d后, 對蝦存活率和體重得率顯著降低, 肝胰腺和腸道的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷嚴重, 消化酶活性顯著降低[11]; 而超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化物酶活性顯著高于對照組, 并呈先升高后降低的趨勢[12]。對肝胰腺和腸道進行差異表達基因分析, 發(fā)現(xiàn)投喂含有AFB1的飼料導(dǎo)致肝胰腺(12 014個)和腸道(1 387個)出現(xiàn)大量差異基因表達, 其中肝胰腺中差異基因主要富集到18條與免疫相關(guān)的通路和過程, 而腸道中富集到 7條[13]; 提示相比于腸道, 肝胰腺是響應(yīng)AFB1刺激的主要組織。同時, 實驗組中腸道菌群的種類和數(shù)量都明顯低于對照組, 且隨著養(yǎng)殖時間的延長, 實驗組中 Proteobacteria、Firmicutes、Vibrio和Photobacterium的豐度不斷增加, Bacteroidetes、Flavobacterium_sp_M和Tenacibaculum的豐度不斷降低[12]。以上結(jié)果表明, 投喂含有5 mg/kg AFB1的飼料會激活凡納對蝦抗氧化和免疫系統(tǒng)功能、造成腸道菌群組成紊亂、降低消化酶活性、造成組織結(jié)構(gòu)損傷, 從而導(dǎo)致對蝦生長受到抑制、死亡率升高。另外, 與高劑量黃曲霉毒素(15 mg/kg)攝入相比, 較低劑量黃曲霉毒素攝入造成對蝦機體損傷的同時,激活對蝦免疫和抗氧化系統(tǒng)以應(yīng)對外界刺激, 表現(xiàn)為大量免疫相關(guān)基因表達量上調(diào)。而高劑量黃曲霉素攝入對對蝦的生長和代謝造成致命性打擊, 表現(xiàn)為大量與代謝相關(guān)的基因表達量下調(diào)。

    1.3 對蝦應(yīng)對環(huán)境脅迫的免疫反應(yīng)機理

    在對蝦養(yǎng)殖中, 水環(huán)境因子對對蝦的生長和病害發(fā)生是至關(guān)重要的影響因素。尤其在目前高密度集約化養(yǎng)殖中, 養(yǎng)殖水質(zhì)的pH波動、溶解氧降低以及養(yǎng)殖密度過高等環(huán)境脅迫常常導(dǎo)致養(yǎng)殖品種攝食量減少、生殖力下降、生長速度減慢, 甚至引起動物死亡。近年來通過分析逐漸降低或升高 pH環(huán)境脅迫、循環(huán)重/中度低氧環(huán)境脅迫以及養(yǎng)殖密度脅迫下對蝦的生長生理、基因表達以及抗病能力等的變化, 對凡納對蝦應(yīng)對環(huán)境脅迫的應(yīng)激反應(yīng)機理有了較為深入的了解, 為水環(huán)境調(diào)控技術(shù)研發(fā)提供理論依據(jù)。

    1.3.1 pH

    針對養(yǎng)殖過程中水環(huán)境 pH值的不斷變化對對蝦養(yǎng)殖造成的危害, 研究了凡納對蝦在逐漸降低pH(6.65~8.20)和逐漸升高 pH(8.20~9.81)的水環(huán)境中存活、生長以及生理生化反應(yīng)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 逐漸升高的 pH造成對蝦更高的死亡率, 在第 28天達到39.9%, 存活的對蝦生長狀態(tài)不佳。而逐漸降低pH中對蝦累計死亡率在第 7天之后穩(wěn)定于 6.67%至第28天, 此過程中增長率和增重率先下降后恢復(fù)正常。此結(jié)果表明蝦能夠適應(yīng)逐漸降低的pH環(huán)境。通過滲透調(diào)節(jié)基因表達、消化酶活性變化等分析對蝦應(yīng)對pH變化的內(nèi)在機理發(fā)現(xiàn), 逐漸降低pH條件下, 蝦的滲透調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄不斷增強, 消化酶活性先下降后恢復(fù)正?;虿粩嘣黾? 而對副溶血弧菌浸浴的死亡率不斷減少。由此可見蝦能夠耐受逐漸降低pH環(huán)境的主要內(nèi)在機制可能主要是其高滲透調(diào)節(jié)能力, 同時通過增強消化酶活性滿足能量消耗[14-15]。對比分析不同pH條件下對蝦肝胰腺和中腸的抗氧化反應(yīng)、氧化應(yīng)激、氧化損傷。結(jié)果顯示, 在養(yǎng)殖環(huán)境pH改變的前期(≤7天), 蝦肝胰腺和中腸的抗氧化酶基因GPx、MnSOD和應(yīng)激蛋白基因Hsp70表達增強, 推測為對蝦的早期適應(yīng)機制, 用于清除環(huán)境脅迫產(chǎn)生的過量活性氧。同時, 肝胰腺相對于中腸而言, 對pH變化及其氧化應(yīng)激更敏感, 這可能與其較早的產(chǎn)生活性氧、抗氧化反應(yīng)和氧化損傷有關(guān)。而在pH改變較長時間(≥14天)后, 逐漸升高pH條件下對蝦由于氧化損傷過重導(dǎo)致肝胰腺和中腸喪失了抗氧化調(diào)節(jié)能力連續(xù)死亡。在逐漸降低pH環(huán)境下養(yǎng)殖較長時間(≥14天)后, 對蝦肝胰腺和中腸的抗氧化酶基因GST、GPx和應(yīng)激蛋白基因Hsp70的轉(zhuǎn)錄增強, 該反應(yīng)可能是蝦為防止ROS進一步干擾而產(chǎn)生抗氧化適應(yīng)機制, 以此減弱氧化損傷, 達到新的免疫穩(wěn)態(tài)。通過上述結(jié)果推斷, 為減輕逐漸升高pH條件對蝦的損傷, 可以重點保護肝胰腺, 從而控制蝦的死亡和生長抑制[14, 16]。

    1.3.2 溶解氧

    溶解氧脅迫是對蝦養(yǎng)殖中經(jīng)常產(chǎn)生的環(huán)境脅迫,為探討對蝦應(yīng)對溶解氧脅迫的反應(yīng)機制, 模擬了循環(huán)重/中度低氧(0.8~3.5 mg/L)脅迫的水環(huán)境, 分析了對蝦在低氧脅迫下的存活、生長、生理生化反應(yīng)以及抗病能力的變化。結(jié)果顯示循環(huán)重/中度低氧脅迫造成蝦的累積死亡率不斷增加, 增重率和增長率不斷下降。分析其內(nèi)在反應(yīng)機制, 發(fā)現(xiàn)消化酶活性不斷下降, 滲透調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄先增加后恢復(fù)正?;蛳陆?副溶血弧菌浸浴的死亡率不斷增加。由此推斷循環(huán)重/中度低氧可通過破壞滲透調(diào)節(jié)機制, 使機體失去了平衡穩(wěn)態(tài), 降低消化酶活性影響對蝦的生存和生長性能, 同時增加弧菌病害暴發(fā)的風(fēng)險[14,17]。對比分析中腸和肝胰腺的抗氧化反應(yīng)和氧化損傷相關(guān)基因、低氧誘導(dǎo)因子1a(HIF-1a)的表達發(fā)現(xiàn), 短期循環(huán)重/中度低氧條件下, 蝦增強中腸和肝胰腺抗氧化酶基因、應(yīng)激蛋白基因和HIF-1a基因的轉(zhuǎn)錄作為早期的適應(yīng)機制, 以耐受低氧并清除過量的活性氧。同時,因為較早的氧化損傷和HIF-1a轉(zhuǎn)錄, 所以肝胰腺比中腸對低氧及其氧化應(yīng)激更敏感。循環(huán)重/中度低氧脅迫持續(xù)較長時間后, 氧化損傷逐漸加重導(dǎo)致蝦中腸和肝胰腺喪失了抗氧化調(diào)節(jié)能力, 最終導(dǎo)致蝦連續(xù)死亡。在此過程中, 肝胰腺比中腸更早喪失了抗氧化調(diào)節(jié)能力。由此提示可以通過保護肝胰腺提高對蝦對循環(huán)重/中度低氧脅迫的適應(yīng)能力[14,18]。

    1.3.3 養(yǎng)殖密度

    對蝦養(yǎng)殖中, 養(yǎng)殖密度的升高在提高產(chǎn)量的同時, 易引發(fā)病害發(fā)生和對蝦生長速度的下降。為了系統(tǒng)地探究對蝦應(yīng)對不同密度養(yǎng)殖和病菌易感性的潛在機制, 分析了高密度組(800尾蝦/m3)和低密度組(400尾蝦/m3)條件下, 對蝦生長和對抗副溶血弧菌感染的能力以及內(nèi)在機制的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高密度養(yǎng)殖會導(dǎo)致對蝦體重得率和對副溶血弧菌的抗病性顯著降低; 進一步分析發(fā)現(xiàn)高密度養(yǎng)殖條件下對蝦肝胰腺和腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯損傷, 攻毒后兩組組織結(jié)構(gòu)皆出現(xiàn)損傷, 但高密度組損傷更為嚴重[19]; 高密度養(yǎng)殖導(dǎo)致對蝦機體抗氧化物酶活性顯著升高, 呈先升高后降低的趨勢[20]; 通過轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析, 發(fā)現(xiàn)高密度養(yǎng)殖組中肝胰腺和腸道中分別有 45和 5 470個差異基因, 其中肝胰腺中差異基因富集到 4條免疫相關(guān)的通路和過程, 而腸道中富集到 14條[19]; 同時, 高密度養(yǎng)殖組中腸道的菌群種類和數(shù)量都顯著低于低密度組, 且隨著養(yǎng)殖時間的延長, 高密度組中 Bacteroidetes、Firmicutes、Pseudoalteromona和Blastopirellula的豐度不斷降低,Planctomycetes、Photobacterium和Vibrio的豐度不斷升高[22]。以上結(jié)果表明, 高密度養(yǎng)殖會破壞凡納對蝦肝胰腺和腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、損傷免疫和抗氧化系統(tǒng)、造成腸道菌群組成紊亂、降低體重得率, 進而導(dǎo)致其抵御副溶血弧菌侵染的能力下降, 最后由于疾病感染造成更高的死亡率。另外, 相比于肝胰腺,腸道對密度脅迫更為敏感。

    2 對蝦病害防控技術(shù)

    國內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)抗生素和化學(xué)藥品濫用已經(jīng)造成嚴重的水產(chǎn)品安全和環(huán)境安全問題, 無抗高效養(yǎng)殖成為未來的發(fā)展方向。我國規(guī)模養(yǎng)殖的環(huán)境條件、密度條件、防疫條件與歐洲國家相比尚有較大距離, 要實現(xiàn)無抗養(yǎng)殖必須要有新技術(shù)的支持和相應(yīng)的替代品。近年來, 研究團隊在探討對蝦免疫反應(yīng)機理的同時, 也在積極尋求安全高效的對蝦病害防控新技術(shù)和新產(chǎn)品。

    2.1 益生菌

    近年來, 微生物組學(xué)研究得力于高通量測序技術(shù)的普及已取得巨大進展, 并且在醫(yī)藥、畜牧養(yǎng)殖等領(lǐng)域已經(jīng)產(chǎn)生了顯著的經(jīng)濟效益, 被列為“能重塑未來的十大新興技術(shù)”之一。目前, 微生物制劑已經(jīng)普遍用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的病害防控和水質(zhì)調(diào)控, 但是對水產(chǎn)動物腸道微生物的認識和益生菌的作用機理尚缺乏最基礎(chǔ)的認知。從解析對蝦腸道微生物組成入手,結(jié)合水生動物來源益生菌的分離篩選和作用機理的分析, 進行了一系列從理論到應(yīng)用的研究開發(fā)工作。在高通量測序技術(shù)尚未普及之前, 采用 PCRDGGE法和16S rDNA文庫法研究分析了中國對蝦(P.chinensis)和日本對蝦(Penaeus japonicus)腸道微生物組成。比較分析了芽抱桿菌等對日本對蝦腸道微生物的影響, 為養(yǎng)殖對蝦腸道微生物區(qū)系的調(diào)控技術(shù)提供理論依據(jù)。結(jié)果表明, 中國對蝦腸道微生物屬于變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門三大類群, 其中變形細菌為優(yōu)勢菌群[21]。采用同樣的方法分析了日本對蝦腸道微生物區(qū)系組成并探討了外源芽孢桿菌攝入對腸道微生物組成的影響, 發(fā)現(xiàn)日本對蝦攝入外源芽抱桿菌后, 腸道微生物中腸桿菌數(shù)量明顯增多,弧菌數(shù)量相對減少[22]。

    隨后, 我們從水生動物腸道中分離篩選得到2株具有較好的抑菌性和黏附性的乳酸菌, 經(jīng)鑒定分別命名為戊糖乳桿菌(Lactobacillus pentosus)HC-2和糞腸球菌(Enterococcus faecium)NRW-2。并深入探討了這兩株菌對凡納對蝦的益生作用及其益生機理。發(fā)現(xiàn) HC-2或 NRW-2可顯著提高對蝦特定生長率; 而HC-2發(fā)酵上清液對特定生長率的影響不顯著。實時定量PCR研究發(fā)現(xiàn), HC-2及其發(fā)酵上清液對肝胰腺中免疫相關(guān)基因的表達具有較高的誘導(dǎo)作用, 而NRW-2可顯著提高對蝦中腸中免疫相關(guān)基因的表達。此外兩株菌均可提高對蝦對病原菌的抵抗力[23-24]。飼料中添加益生菌及其發(fā)酵上清液可不同程度提高凡納對蝦腸道和肝胰腺的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等活性, 但在不同組織中提高消化酶活性的種類是不同的[23,25]。利用高通量測序技術(shù)分析凡納對蝦腸道中的細菌菌群多樣性, 數(shù)據(jù)顯示 Verrucomicrobia,Proteobacteria和Actinobacteria是對蝦腸道的優(yōu)勢菌群, 飼料中添加 HC-2發(fā)酵上清液可顯著提高了對蝦腸道中 Actinobacteria的豐度, 但是對腸道的形態(tài)結(jié)構(gòu)沒有明顯的改善作用, 由此推測益生菌的代謝產(chǎn)物可能通過調(diào)節(jié)對蝦腸道中微生物群落結(jié)構(gòu), 進而通過微生物群落之間復(fù)雜的相互作用實現(xiàn)對蝦健康方面的保持或促進作用[23,26]。

    為進一步探討益生菌的作用機理, 對益生菌HC-2和副溶血弧菌E1(VPE1)進行熒光標記后, 觀察了其在對蝦腸道中的分布情況。發(fā)現(xiàn)在對蝦腸道內(nèi)HC-2對VPE1具有一定的競爭排斥作用。分析HC-2與VPE1的體外共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn), HC-2可抑制VPE1的生長, HC-2中LuxS基因可能參與到HC-2對VPE1的競爭排斥過程。另一方面, 熱失活的HC-2菌體可以顯著促進VPE1中的毒力相關(guān)基因的表達[23,27]。

    鑒于HC-2在對蝦腸道表現(xiàn)較好的定植性能, 進一步研究了益生菌表面蛋白在益生作用中的機制。分別用正常乳酸菌 HC-2和 LiCl除去表面蛋白的HC-2連續(xù)投喂對蝦四周, 然后用致病菌副溶血弧菌弧菌VPE1進行攻毒。電鏡觀察和免疫組化研究結(jié)果顯示正常 HC-2對腸道和肝胰腺起到良好的保護作用, 但是除去表面蛋白的HC-2沒能改善對蝦腸道表面環(huán)境; 對蝦腸道和肝胰腺中免疫相關(guān)基因表達水平、免疫和消化相關(guān)酶活性水平在投喂去除表面蛋白的乳酸菌后受到顯著影響; 去除表面蛋白顯著影響了乳酸菌在對蝦腸道的定植, 降低了對蝦在攻毒實驗中的存活率; Illumina測序分析結(jié)果顯示投喂正常HC-2組的致病菌顯著下降, 而有益菌數(shù)量顯著增加, 但是在投喂LiCl處理的HC-2組中沒有發(fā)現(xiàn)這一重要現(xiàn)象[28-29]。該結(jié)果表明HC-2的表面蛋白在其黏附定植、改善對蝦腸道絨毛層結(jié)構(gòu)、保護對蝦肝胰腺、競爭性排除病原菌、增強腸道免疫反應(yīng)抵抗疾病等益生功能調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用。利用GO/KEGG富集分析對蝦腸道轉(zhuǎn)錄組顯著差異表達基因發(fā)現(xiàn), 跟免疫、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、離子穩(wěn)態(tài)、細胞黏附、壓力/刺激應(yīng)激、血管內(nèi)皮生長因子和圍食膜因子等相關(guān)基因在添加正常 HC-2對蝦腸道中呈顯著上調(diào)表達, 這些重要基因的上調(diào)表達將提高對蝦腸道的免疫應(yīng)答、營養(yǎng)代謝、上皮細胞生長、菌體黏附定植等功能, 從而提高對蝦抵御病原菌感染和抗病能力[30]。但是添加沒有表面蛋白的HC-2不能誘導(dǎo)對蝦腸道中這些基因的上調(diào)表達。該結(jié)果在基因水平證明表面蛋白是乳酸菌 HC-2在蝦中腸中發(fā)揮益生菌作用關(guān)鍵因子。利用GO和KEGG富集分析對蝦腸道顯著差異表達蛋白發(fā)現(xiàn), 參與免疫系統(tǒng)過程、代謝過程、黏附過程和細胞-細胞信號過程相關(guān)的蛋白在添加正常 HC-2對蝦腸道中呈顯著上調(diào)表達, 而在添加經(jīng)LiCl除去表面蛋白的HC-2投喂對蝦腸道中呈顯著下調(diào)表達[31]。該研究結(jié)果在蛋白水平證明了表面蛋白在介導(dǎo) HC-2調(diào)節(jié)對蝦腸道免疫應(yīng)答、營養(yǎng)代謝、細菌黏附和信號傳遞過程中發(fā)揮了重要作用。

    在深入探討乳酸菌益生機理的同時, 致力于研發(fā)乳酸菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的高效應(yīng)用技術(shù)。考慮到乳酸菌制劑菌量衰減快、保存期較短等特性, 為最大限度地獲得高含量的活菌與代謝產(chǎn)物, 開發(fā)了乳酸菌現(xiàn)場小型生物工程發(fā)酵罐裝置, 該裝置可以自動加溫消毒及恒溫控制等, 控制精準, 穩(wěn)定性好, 安全耐用, 并強化了保溫性能, 節(jié)約能源, 可簡便、精確、快速地進行現(xiàn)場發(fā)酵。復(fù)合乳酸菌經(jīng)現(xiàn)場培養(yǎng)后, 菌體均處于增殖高峰期, 菌數(shù)含量高(可達2.0×109CFU/mL)、菌體活力強, 投放后可最大程度的發(fā)揮作用。基于對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)的實踐, 建立了乳酸菌的現(xiàn)場生產(chǎn)和使用規(guī)程。應(yīng)用后發(fā)現(xiàn)其促進攝食、加速生長及降低發(fā)病率等功效突出, 根據(jù)追蹤觀察以及養(yǎng)殖戶反映, 乳酸菌拌料后對蝦攝食迅速, 而且不隨環(huán)境的變化而上下波動, 腸道更加清晰且粗壯,在后期腸炎高發(fā)時, 乳酸菌拌料的池塘幾乎沒有發(fā)生腸炎。

    2.2 功能蛋白

    重組抗菌肽是一類利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的小分子多肽, 其特點是分子量小、熱穩(wěn)定好、具有廣譜抗菌活性, 在解決病原微生物對抗生素不斷增強的抗性方面, 被公認為具有極大應(yīng)用潛力。從承擔(dān)十一五863項目“抗病功能蛋白漁藥研制”開始, 進行了一系列抗病功能蛋白的基因克隆和重組表達的研究工作。先后從中國對蝦中克隆了一個血藍蛋白基因FcHC, 通過與已有抗菌肽序列的分析比對發(fā)現(xiàn)中國明對蝦血藍蛋白的 C末端存在有抗菌肽的可能性。為進一步確認其 C末端(FcHC-C)的抗菌功能, 將血藍蛋白2個C末端基因片段連接到畢赤酵母表達載體pPIC9K中, 實現(xiàn)了血藍蛋白2個C末端抗菌肽的重組表達。體外抑菌實驗顯示, 重組多肽 rFcHC-C1和 rFcHC-C2作為陰離子抗菌肽具有抗真菌和抗細菌的活性[32-34]。

    同時, 對重組表達的其它抗菌肽進行了發(fā)酵工藝和給藥途徑的研究。對大腸桿菌表達的抗脂多糖因子進行了發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件的優(yōu)化, 獲得了抗脂多糖因子原核重組表達的最佳培養(yǎng)基組成和最佳培養(yǎng)條件, 優(yōu)化后的目的蛋白產(chǎn)量是優(yōu)化前的2.16倍。參考搖瓶培養(yǎng)條件, 對原核表達的抗脂多糖因子在發(fā)酵罐中進行了高密度發(fā)酵, 得到目的蛋白占總可溶性蛋白的10.5%[35-36]。

    重組蛋白類藥物與抗生素相比存在穩(wěn)定相差、半衰期短、易被消化酶降解等問題, 極大的影響了其口服給藥的有效性。在實際應(yīng)用中, 通過微膠囊化技術(shù)對重組多肽進行控/緩釋作用是一種有效的解決途徑。嘗試以海藻酸鈉為壁材對重組表達的對蝦素進行了微膠囊化處理, 采用凝聚法制備了重組抗菌肽-海藻酸鈉微囊, 得到包封率 83.87%的微囊。微囊在模擬胃液中釋放率較低, 2 h釋放量低于14%, 而在模擬腸液中持續(xù)釋放, 5 h時釋放量達98%, 可見海藻酸鈉微囊可保護重組抗菌肽抵抗胃液的破壞, 同時具有良好的腸溶性。上述結(jié)果為解決重組抗菌肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的口服給藥問題, 促進其在水產(chǎn)病害防治過程的應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)和理論支持[37-38]。動物養(yǎng)殖實驗表明, 飼料中添加5~20 mg/kg重組對蝦素可顯著降低嗜水氣單胞菌對羅非魚造成的死亡率,低劑量重組抗菌肽(5~10 mg/kg)可顯著提高羅非魚的增重率。通過分析羅非魚的生理生化反應(yīng)發(fā)現(xiàn)重組對蝦素提高了羅非魚的紅細胞總數(shù)以及過氧化氫酶的活性; 但是高劑量對蝦素(50 mg/kg)對羅非魚造成明顯的毒副作用[35,39]。

    2.3 生物發(fā)酵飼料

    生物飼料被國際上公認為是極具潛力的“第四代飼料”, 近年來得到國內(nèi)外關(guān)注。所謂生物飼料是指利用基因工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等高新技術(shù)所開發(fā)的新型飼料資源, 如酶制劑、益生菌、生物活性肽和寡糖等。它可以提高飼料效價和利用率, 有效節(jié)約資源, 大幅度減少環(huán)境和水體污染, 有效增強動物的免疫抗病力, 預(yù)防病害, 保證安全, 杜絕有害物和違禁品使用等。

    通過生物酶解動物蛋白制備小肽, 使其具有更高的吸收利用率; 利用復(fù)合益生菌發(fā)酵植物蛋白包括生粕、豆粕和麩皮等, 發(fā)酵的植物蛋白含有更高的益生菌含量、高蛋白、高消化率并且原料低廉易得;將飼料酵母經(jīng)過特殊工藝誘導(dǎo)自溶及超微破壁, 釋放胞內(nèi)及胞壁活性物質(zhì)且得以全部保留, 破壁率高達 91.6%。將上述新型原料經(jīng)過合理平衡和有機集成, 開發(fā)出新型的對蝦生物飼料, 與普通飼料相比,具有低蛋白、高消化率、富含益生活菌及有機酸等特點。采用上述工藝制備的生物飼料進行了 8周的生產(chǎn)性養(yǎng)殖試驗, 結(jié)果表明生物飼料可顯著提高對蝦的生長性能和存活率, 降低飼料系數(shù)。分析攝食生物飼料的對蝦的各項生化指標發(fā)現(xiàn), 對蝦的 SOD、血清總蛋白含量、溶菌活性及對蝦總蛋白酶活性較普通飼料組有顯著提高, 但是抑菌活性未發(fā)現(xiàn)顯著差異。生物飼料組水體中的 NH4-N、NO2-N等水質(zhì)指標略低于普通飼料組, 但兩者無顯著差異[40]。

    同時, 我國凡納濱對蝦養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大, 作為對蝦配合飼料主要蛋白源的魚粉產(chǎn)量逐年下降,價格逐年攀升, 尋找魚粉的替代物已經(jīng)成為凡納濱對蝦養(yǎng)殖業(yè)面臨的現(xiàn)實問題, 也是對蝦飼料和營養(yǎng)學(xué)研究領(lǐng)域的重點和難點問題。近年來評估了幾種魚粉替代源在對蝦養(yǎng)殖中的可行性并分析了其影響對蝦生長的內(nèi)在機制。首先, 進行了生物絮團替代魚粉的生產(chǎn)應(yīng)用評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)以生物絮團替代 15%的魚粉并未對對蝦的生長產(chǎn)生影響, 而且在消化酶活性以及生長代謝相關(guān)基因的表達調(diào)控方面并無顯著差異, 說明以生物絮團替代 15%的魚粉在生產(chǎn)上是可行的[41-42]。其次, 探討了青貯魚粉替代魚粉的可行性及合理替代水平。結(jié)果表明以青貯魚粉替代25%的魚粉, 對凡納對蝦的生長和生長代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)未造成顯著影響。高水平替代(50%~100%)會顯著降低對蝦生長, 分析其內(nèi)在機理發(fā)現(xiàn)對蝦體內(nèi)mTOR信號通路和腸道微生物菌群發(fā)生了顯著改變,表明如果以青貯魚粉替代凡納濱對蝦飼料中的魚粉,替代量少于 25%是較為可行的[41,43]。再次, 探討了發(fā)酵豆粕替代凡納濱對蝦配合飼料中魚粉的可行性。結(jié)果顯示以發(fā)酵豆粕替代凡納濱對蝦飼料中20%的魚粉可顯著促進對蝦的生長、消化和生長代謝調(diào)控通路。并發(fā)現(xiàn)mTOR信號通路中關(guān)鍵基因的表達與生長表現(xiàn)之間呈現(xiàn)高度一致性, 但是發(fā)酵豆粕替代對腸道微生物菌群未產(chǎn)生顯著的影響。由此可見發(fā)酵豆粕替代對蝦配合飼料中 20%魚粉是合理的替代方案, 并可通過影響 mTOR信號通路相關(guān)基因的表達達到促生長的效果[41,44-45]。

    3 研究展望

    3.1 組學(xué)時代的對蝦病害防控

    深入解析養(yǎng)殖物種生產(chǎn)性狀的內(nèi)在遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)對于提高養(yǎng)殖效率具有至關(guān)重要的作用。近年來,隨著組學(xué)技術(shù)(轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因組學(xué)、微生物組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué))的飛速發(fā)展和推廣應(yīng)用, 使我們對水產(chǎn)動物的生命過程有了越來越深入的了解。其中隨著對蝦基因組序列的破譯, 讓我們對對蝦的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)有了全面的認知。與此同時, 頻發(fā)的病害和防治技術(shù)的缺乏導(dǎo)致對蝦養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生巨大損失, 世界范圍內(nèi)很多研究團隊投入大量精力發(fā)掘有應(yīng)用潛力的對蝦基因資源。然而, 基因資源的發(fā)掘離實際應(yīng)用尚有很長的距離。對蝦病害防控技術(shù)的發(fā)展將進一步依托組學(xué)技術(shù)提供的龐大信息資源, 通過對數(shù)據(jù)的積累與分析, 著眼于對蝦自身的生命過程解析及體內(nèi)外共生微生物的功能分析, 深入探討影響對蝦養(yǎng)殖的“環(huán)境組-微生物組-表型組”三者相互作用關(guān)系, 為對蝦養(yǎng)殖的環(huán)境因子調(diào)整、安全投入品研發(fā)等提供理論和技術(shù)支撐。

    3.2 對蝦養(yǎng)殖模式升級與病害防控

    近年來, 隨著現(xiàn)代信息技術(shù)和物聯(lián)網(wǎng)、云計算等技術(shù)的快速發(fā)展, 大數(shù)據(jù)和物聯(lián)網(wǎng)被越來越多地應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè), 但是其發(fā)展速度和技術(shù)水平明顯落后于其他產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用。水產(chǎn)業(yè)作為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的重要組成部分, 其智能化和信息化程度尤為薄弱, 主要表現(xiàn)在: 集約化程度低、各自經(jīng)營為主、信息無法共享; 環(huán)境、病原等檢測能力弱, 更缺乏分析處理能力; 缺乏技術(shù)服務(wù)支撐、缺乏分析總結(jié)、缺乏科學(xué)模式等, 造成病害防控困難, 環(huán)境污染難以控制等嚴重問題, 這些問題在對蝦養(yǎng)殖中表現(xiàn)的更加突出。隨著互聯(lián)網(wǎng)和信息化技術(shù)的飛速發(fā)展, 基于水產(chǎn)大數(shù)據(jù)的智慧化養(yǎng)殖是實現(xiàn)水產(chǎn)規(guī)?;瘶藴驶谋厝恢?。物聯(lián)網(wǎng)技術(shù)在國內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用較為少見, 多數(shù)停留在學(xué)術(shù)研究方面。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)信息與電氣工程學(xué)院李道亮教授團隊圍繞我國水產(chǎn)集約養(yǎng)殖數(shù)字化發(fā)展和全程自動監(jiān)控及科學(xué)管理的重大需求開展研究工作, 積極開展了養(yǎng)殖水質(zhì)傳感器、水產(chǎn)養(yǎng)殖優(yōu)化調(diào)控模型、水產(chǎn)養(yǎng)殖智能裝備研究。提出了水產(chǎn)養(yǎng)殖實時數(shù)據(jù)在線處理模型與方法, 構(gòu)建了基于實時數(shù)據(jù)與知識庫聯(lián)合驅(qū)動的魚類生長動態(tài)優(yōu)化調(diào)控模型。水產(chǎn)集約化養(yǎng)殖測控技術(shù)依靠精準的、自動化的、機械的、變量的一種生產(chǎn)方式, 增氧更合理, 投餌更合理, 使養(yǎng)殖密度增加[46]。但是針對對蝦養(yǎng)殖的智能化管控技術(shù)尚無實際運行的案例。今后的工作通過水質(zhì)環(huán)境監(jiān)測、對蝦攝食行為分析、管理數(shù)據(jù)收集、大數(shù)據(jù)分析、智能投飼系統(tǒng)等各關(guān)鍵要素的系統(tǒng)分析和數(shù)據(jù)應(yīng)用, 建立對蝦養(yǎng)殖智能化管控平臺, 通過整合物聯(lián)網(wǎng)技術(shù),實現(xiàn)數(shù)據(jù)科學(xué)分析, 設(shè)施裝備智能化、自動化管控,產(chǎn)業(yè)整體要素重組和全面提升, 實現(xiàn)對蝦健康生態(tài)養(yǎng)殖。

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