尿素包合法富集沙棘果油棕櫚油酸的工藝優(yōu)化

李 偉 ， 李保國，姜元榮，周盛敏

(1.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093； 2.豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司，上海 200137)

棕櫚油酸是一種十六碳的單不飽和脂肪酸(MUFA)，雙鍵位于第7個碳原子上，具有較好的穩(wěn)定性[1]。研究表明，棕櫚油酸能夠改善皮膚的持水性和彈性，提高人體的免疫力。近年來，研究發(fā)現(xiàn)棕櫚油酸對一些慢性疾病如代謝綜合征、糖尿病和炎癥等具有治療作用，從而引起人們廣泛關(guān)注[2-7]。棕櫚油酸在一般油料作物中含量較少，主要存在深海魚油、昆士蘭果油和沙棘果油中，其中沙棘果油中棕櫚油酸含量高達30%左右。我國的沙棘資源豐富，如若利用我國現(xiàn)有的沙棘資源進行棕櫚油酸的生產(chǎn)，在充分利用自然資源的同時也可以改善種植戶的經(jīng)濟收入。

目前常見的脂肪酸分離方法有低溫結(jié)晶法、超臨界CO2萃取技術(shù)、硝酸銀柱層析法、尿素包合法及脂肪酶水解法等[8-12]。其中，尿素包合法因具有操作簡單、溶劑可回收利于保護環(huán)境、降低成本等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用[13]。因此，本試驗利用尿素包合法富集沙棘果油中棕櫚油酸，研究包合時間、包合溫度、醇脲比及脲脂比對棕櫚油酸含量的影響，并利用響應(yīng)面試驗設(shè)計確定最佳富集工藝條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

壓榨沙棘果油，艾康生物技術(shù)有限公司。95%乙醇、尿素、無水硫酸鈉、氫氧化鉀、鹽酸、石油醚(沸程60～90℃)，分析純；正己烷，色譜純；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

ML104/02電子天平、FE20型pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；X3管式離心機、揮發(fā)性物質(zhì)精餾濃縮裝置，賽默飛世爾科技公司；R06 B2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Agilent 7890A型氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 沙棘果油混合脂肪酸的制備

向燒瓶中加入112 g氫氧化鉀和95%乙醇1 200 mL，在80℃的水浴下攪拌回流至氫氧化鉀完全溶解后加入120 g沙棘果油，攪拌回流2 h。將反應(yīng)液冷卻至室溫后加入400 mL去離子水、400 mL正己烷混合均勻后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中。取下層，使用濃鹽酸調(diào)pH至2～3，再加入適量正己烷進行萃取，萃取液加入適量無水硫酸鈉，過濾，取濾液旋蒸20 min，得到沙棘果油混合脂肪酸。按下式計算混合脂肪酸得率。

1.2.2 尿素包合法富集棕櫚油酸

在三口燒瓶中加入一定量的95%乙醇及尿素，在80℃水浴鍋中攪拌回流0.5 h至尿素完全溶解。加入一定量的混合脂肪酸，繼續(xù)攪拌回流1 h。待混合溶液冷卻至室溫后置于一定溫度條件下包合不同時間。然后在低溫條件下迅速抽濾，取濾液加入適量石油醚，用10%鹽酸將pH調(diào)至2～3，加入50 mL去離子水，倒入分液漏斗靜置、分層，水相再用石油醚萃取，分液漏斗分離，合并兩次石油醚相，用60℃去離子水洗至中性，再通過裝有無水硫酸鈉的漏斗，在60℃下將濾液旋蒸20 min，得到包合后的混合脂肪酸，稱重。按下式計算棕櫚油酸回收率。

棕櫚油酸回收率=(產(chǎn)品質(zhì)量×產(chǎn)品中棕櫚油酸含量)/(沙棘果油混合脂肪酸質(zhì)量×棕櫚油酸含量)×100%

1.2.3 脂肪酸組成及含量的測定

采用GB 5009.168—2016中三氟化硼法進行甲酯化，采用氣相色譜儀進行測定。色譜條件：CP-Sil 88 熔融石英毛細管柱(50 m×250 μm×5 μm)；氫火焰離子檢測器，溫度280℃；升溫程序為起始溫度80℃，以10℃/min升至120℃，保持2 min，再以5℃/min升至180℃，再以2℃/min升至206℃，再以25℃/min升至230℃，保持5 min；載氣(H2)，恒壓模式下壓力1.02×105Pa;進樣口溫度250℃，進樣量0.2 μL；分流比75∶1。采用峰面積歸一化法進行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪酸組成及含量(見表1)

表1 脂肪酸組成及含量 %

注：沙棘果油中含量不足1%的脂肪酸共計0.227%；“-”表示未檢出。

由表1可知，沙棘果油共檢測出8種脂肪酸，其中棕櫚酸、棕櫚油酸和油酸含量較高，分別為30.81%、30.74%、31.47%。由沙棘果油制備的混合脂肪酸得率為73.30%，棕櫚油酸含量為30.28%。

2.2 單因素試驗

2.2.1 包合時間對富集棕櫚油酸的影響

在包合溫度-4℃、醇脲比4∶1(體積質(zhì)量比，下同)、脲脂比2∶1(質(zhì)量比，下同)的條件下，考察尿素包合時間對富集效果的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 尿素包合時間對棕櫚油酸含量的影響

由圖1可知，隨著包合時間的延長，棕櫚油酸含量和回收率呈現(xiàn)先升高后下降的規(guī)律，在包合時間為12 h時達到最大值，此時棕櫚油酸含量為53.82%，棕櫚油酸回收率為29.65%。尿素包合是一個包合和解包合的動態(tài)平衡過程，隨著反應(yīng)時間的延長，反應(yīng)越充分，尿素與飽和脂肪酸的包合程度越大，棕櫚油酸的含量也隨之升高[14]。但包合超過一定時間后，部分尿素會以晶體的形式析出，使得包合過程趨向解包合的方向進行，導(dǎo)致棕櫚油酸含量下降。因此，選擇包合時間為12 h。

2.2.2 包合溫度對富集棕櫚油酸影響

在包合時間12 h、醇脲比4∶1、脲脂比2∶1的條件下，考察尿素包合溫度對富集效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 尿素包合溫度對棕櫚油酸含量的影響

由圖2可知，隨著包合溫度的升高，棕櫚油酸回收率呈現(xiàn)下降趨勢，棕櫚油酸含量開始升高，在-4℃時達到最大值53.82%。隨著包合溫度的繼續(xù)升高，棕櫚油酸含量降低。這是因為，隨著溫度升高，尿素的結(jié)晶量減少，被包合的棕櫚油酸的量減少，從而濾液中棕櫚油酸含量也隨著升高。然而，溫度過高不利于反應(yīng)向生成包合物的方向進行，造成未被包合的飽和脂肪酸量增加，導(dǎo)致棕櫚油酸含量降低[14-15]。綜合考慮，選取包合溫度-4℃為宜。

2.2.3 醇脲比對富集棕櫚油酸的影響

在包合時間12 h、包合溫度-4℃、脲脂比2∶1的條件下，考察醇脲比對富集效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 醇脲比對棕櫚油酸含量的影響

由圖3可知，隨著醇脲比增大，棕櫚油酸含量及回收率先升高后下降。在醇脲比為4∶1時，棕櫚油酸含量及回收率達到最大值，分別為53.82%、29.65%。95%乙醇為結(jié)晶過程提供傳熱和傳質(zhì)的載體，隨著95%乙醇用量的增大，尿素對飽和脂肪酸的包合程度增大，棕櫚油酸含量升高。當95%乙醇的用量超過一定量時，會導(dǎo)致尿素濃度降低，使包合反應(yīng)逆向進行，棕櫚油酸含量及回收率隨之降低[16]。綜合考慮，選擇醇脲比為4∶1。

2.2.4 脲脂比對富集棕櫚油酸的影響

在包合時間12 h、包合溫度-4℃、醇脲比4∶1的條件下，考察脲脂比對富集效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 脲脂比對棕櫚油酸含量的影響

由圖4可知，隨著脲脂比增大，棕櫚油酸含量先升高后略有下降，棕櫚油酸回收率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在脲脂比為2.5∶1時棕櫚油酸回收率達到最大值，為31.48%，此時棕櫚油酸含量也較高，為53.62%。尿素量增大，有利于包合飽和脂肪酸，但尿素量過大，會造成棕櫚油酸被包合除去。綜合考慮，選取脲脂比2.5∶1。

2.3 響應(yīng)面試驗優(yōu)化富集棕櫚油酸工藝

在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用Design Expert 8.0.6軟件的試驗設(shè)計原理，設(shè)計四因素三水平Box-Behnken中心組合試驗，因素和水平編碼見表2，試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表2 因素和水平編碼

表3 試驗設(shè)計方案及結(jié)果

續(xù)表3

試驗號ABCD棕櫚油酸含量/%120-10-150.9413011052.2514101052.451500-1-151.881610-1047.2117000054.0918110049.9319001151.1520001-150.19211-10047.9422-100-151.3823-100149.72240-10144.7425010-149.6126100-150.7327000054.4828-10-1053.18290-1-1049.76

運用Design-Expert 8.0.6軟件對表3中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到尿素包合沙棘果油棕櫚油酸工藝參數(shù)的二次回歸方程：棕櫚油酸含量=54.03-0.54A+1.02B+0.47C-0.92D+0.18AB+1.46AC+0.17AD+1.45BC+1.63BD+1.12CD-1.60A2-3.29B2-1.26C2-2.11D2。

表4 方差分析

注：*差異顯著；**差異極顯著。

根據(jù)所得響應(yīng)面數(shù)據(jù)，用Design-Expert. 8.0.6軟件擬合優(yōu)化，得到在包合時間11.84 h、醇脲比4.91∶1、包合溫度-3.33℃及脲脂比2.45∶1的條件下，沙棘果油棕櫚油酸含量最高，為54.23%。為了檢驗回歸模型的有效性，并考慮操作的方便性，將富集工藝參數(shù)修正為包合時間12 h、醇脲比5∶1、包合溫度-4℃及脲脂比2.5∶1，在此條件下進行驗證試驗，得到的棕櫚油酸含量為54.80%，棕櫚油酸回收率為32.46%。棕櫚油酸含量與預(yù)測值相近，說明該方法與實際情況擬合良好，驗證了此回歸模型有效。

3 結(jié) 論

本研究通過單因素試驗探討了包合時間、脲脂比、包合溫度及醇脲比對富集沙棘果油中棕櫚油酸的影響，在此基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面Design-Expert 8.0.6軟件對富集工藝參數(shù)進行優(yōu)化，得到的優(yōu)化條件為包合時間12 h、脲脂比2.5∶1、包合溫度-4℃ 及醇脲比5∶1，該條件下富集沙棘果油中的棕櫚油酸含量從30.28%升高到54.80%，回收率為32.46%。