豬主動脈瓣內(nèi)皮細(xì)胞的分離與鑒定

既往鈣化性主動脈瓣疾病(CAVD)被認(rèn)為是不可逆的被動的退行性病變。但越來越多的臨床研究發(fā)現(xiàn)，CAVD是包括內(nèi)皮損傷、慢性炎性反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)、細(xì)胞表型分化及細(xì)胞凋亡等多個(gè)復(fù)雜病理變化的過程，為主動過程[1-4]。內(nèi)皮損傷可能是CAVD的起始因素[5]，隨后瓣膜間質(zhì)細(xì)胞(VIC)在多種因素刺激下向成骨細(xì)胞樣細(xì)胞主動轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致瓣膜中鈣鹽沉積[6]。有學(xué)者認(rèn)為瓣膜內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)參與CAVD的主要機(jī)制為VEC通過內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換機(jī)制(EndMT)轉(zhuǎn)化成為具有增殖能力的VIC[7-8]，另有學(xué)者認(rèn)為VEC主要通過旁分泌機(jī)制影響VIC的形態(tài)學(xué)特征或功能[9-10]。目前對于VEC在CAVD發(fā)展過程中的始動作用機(jī)制尚未明確。體外分離和培養(yǎng)VEC是深入研究VEC在CAVD病理生理中改變的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，本文探討豬主動脈瓣VEC的分離和培養(yǎng)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和試劑

2～3月齡雄性家豬由上海五豐上食公司提供。高糖DMEM培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素、胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco公司；Ⅱ型膠原酶粉劑購自美國Sigma公司；CD31抗體購自于美國abcam公司(ab28364)，波形蛋白(Vimentin)熒光直標(biāo)抗體購自于美國Santa Cruz公司(sc6260)，α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體購自于美國Affinity公司(AF1032)，熒光二抗Alexa Fluor 488購自于美國EarthOx公司(E032211-01)；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM)購自于美國ScienCell公司。

Ⅱ型膠原酶溶液使用DMEM培養(yǎng)基配制，Ⅱ型膠原酶終濃度為2 mg/mL，青霉素/鏈霉素終濃度為1%。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)使用DMEM完全培養(yǎng)基，青霉素/鏈霉素終濃度為1%。

1.2 主動脈瓣內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

于屠宰場處死家豬后立即切除其主動脈瓣，放置在消毒的無紡布上，佩戴無菌手套和口罩，用高溫滅菌的器械取出瓣膜，放置于預(yù)冷的PBS中，于1 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。使用無菌PBS反復(fù)清洗豬主動脈瓣，共3次，每次3 min。將瓣膜置于培養(yǎng)皿中，加入6 mL預(yù)熱的Ⅱ型膠原酶溶液并放入37 ℃培養(yǎng)箱中孵育5～10 min。輕輕移除內(nèi)皮層，用干燥的無菌棉簽刮擦瓣膜表面，使內(nèi)皮細(xì)胞從組織中分離出來。所施加的力量為能感受到組織的阻力，但未穿透基底膜。在Ⅱ型膠原酶溶液中涂抹棉簽，使內(nèi)皮細(xì)胞中從棉簽中分離出來。收集細(xì)胞懸液，以1 500 轉(zhuǎn)/min離心5 min，去除上清液。用DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞移入培養(yǎng)皿中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，而后改用ECM培養(yǎng)細(xì)胞。

1.3 免疫熒光染色法檢測豬主動脈瓣內(nèi)皮細(xì)胞(PAVEC)

將細(xì)胞接種到12孔板，待細(xì)胞貼壁后培養(yǎng)細(xì)胞至融合度達(dá)30%～50%。75%乙醇室溫固定細(xì)胞15 min，PBS洗3次后，1%Triton-100室溫破膜10 min，5%BSA室溫封閉30 min。加入1∶200一抗(抗CD31抗體、抗Vimentin抗體、抗α-SMA抗體)4 ℃孵育過夜，1∶400 Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗37 ℃避光孵育30 min，4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(DAPI)復(fù)染細(xì)胞核，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測分離細(xì)胞CD31和Vimentin的表達(dá)

胰酶消化12孔板中的細(xì)胞，離心去除上清，1% Triton-100室溫破膜10 min，5% BSA封閉30 min。1∶200一抗(抗CD31抗體、抗Vimentin抗體)4 ℃孵育過夜，Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗37 ℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測分離細(xì)胞的CD31和Vimentin表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 VEC形態(tài)

從新鮮豬主動脈瓣膜分離獲取的VEC約8 h貼壁，分離后第2天VEC增殖速度顯著增快，第3天時(shí)VEC匯集成單層，互相接觸抑制，細(xì)胞形態(tài)呈鋪路石樣。

2.2 VEC表型鑒定

通過免疫熒光染色法對細(xì)胞進(jìn)行表型鑒定，結(jié)果顯示VEC的CD31染色為陽性，α-SMA和Vimentin染色為陰性，VIC的Vimentin和α-SMA染色為陽性，CD31染色為陰性(見圖1)，分離培養(yǎng)的VEC為PAVEC，且VIC污染率低。通過流式細(xì)胞儀進(jìn)一步對細(xì)胞進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示VEC的Vimentin陽性率為3.06%，CD31陽性為99.01%，為CD31+Vimentin-細(xì)胞，VIC的Vimentin陽性率為97.76%，CD31陽性率為0.99%，為CD31-Vimentin+細(xì)胞(見圖2)。主動脈瓣由VEC和VIC構(gòu)成，VEC主要表達(dá)CD31和血管性血友病因子(vWF)，VIC主要表達(dá)Vimentin和α-SMA，而分離獲取的細(xì)胞以CD31+Vimentin-細(xì)胞為主，因此可以認(rèn)為通過膠原酶消化法獲取的VEC沒有VIC污染，再次驗(yàn)證膠原酶消化法分離獲得的VEC純度較高。

3 討論

VEC起源于胚胎發(fā)育時(shí)期的中胚層，其覆蓋于瓣膜的外表面，與VIC及細(xì)胞外基質(zhì)共同構(gòu)成瓣膜。VEC直接接觸血流，因此血流動力學(xué)及炎性改變均能直接作用于VEC[12]。從某種意義上說，VEC可以作為一個(gè)探測器，感受外界的變化，然后通過調(diào)節(jié)基底膜的滲透性、炎性細(xì)胞黏附能力轉(zhuǎn)導(dǎo)外界的信號變化，維持瓣膜內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[13]。越來越多的研究證明，VEC在CAVD的發(fā)生過程中可能起著始動作用。

在本研究中，我們通過膠原酶消化法，將瓣膜表面的VEC分離出，在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3 d后，再改用內(nèi)皮培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。該方法有助于細(xì)胞的狀態(tài)恢復(fù)和分裂，但整體來說細(xì)胞產(chǎn)量較低。值得注意的是，內(nèi)皮細(xì)胞接觸抑制可導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化，因此細(xì)胞傳代時(shí)機(jī)的選擇非常重要。分離出的細(xì)胞呈典型的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，單層生長，呈鋪路石樣。通過免疫熒光染色法檢測細(xì)胞CD31、Vimentin和α-SMA等表型，顯示VEC為CD31表達(dá)陽性，Vimentin和α-SMA表達(dá)陰性細(xì)胞，符合內(nèi)皮細(xì)胞的表型特點(diǎn)。進(jìn)一步通過流式細(xì)胞儀對獲取的細(xì)胞進(jìn)行表型鑒定，VEC為CD31+Vimentin-細(xì)胞，同時(shí)顯示該分離方法獲得的VEC純度較高，受間質(zhì)細(xì)胞污染率低。

注：VEC呈現(xiàn)CD31染色陽性，Vimentin和α-SMA染色陰性；VIC呈現(xiàn)Vimentin和α-SMA染色陽性，CD31染色陰性

圖1 免疫熒光染色法鑒定VEC細(xì)胞表型

注：VEC Vimentin陽性率為3.06%，CD31陽性率為99.01%；VIC Vimentin陽性率為97.76%，CD31陽性率為0.99%

圖2 流式細(xì)胞儀鑒定VEC細(xì)胞表型

VEC在CAVD發(fā)生過程中的始動作用機(jī)制可能為：(1)血流動力學(xué)改變對VEC的影響。有研究表明，在紊亂的血流剪切力作用下，與促鈣化、炎性反應(yīng)相關(guān)的基因，包括骨形成蛋白-4(BMP-4)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)等的表達(dá)升高[14]。(2)VEC通過EndMT成為具有增殖能力的VIC。Paruchufi等[15]研究發(fā)現(xiàn)，成年人瓣膜中存在同時(shí)表達(dá)CD31、α-SMA的細(xì)胞，即發(fā)生EndMT的細(xì)胞。Dal-Bianco等[16]通過構(gòu)建機(jī)械損傷羊瓣膜模型，發(fā)現(xiàn)處理組中內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT的細(xì)胞數(shù)量明顯高于對照組。(3)VEC旁分泌機(jī)制發(fā)生變化，影響 VIC 的形態(tài)學(xué)和功能。VEC主要通過旁分泌一氧化氮(NO)和C型利尿鈉肽(CNP)對VIC進(jìn)行調(diào)控[17-18]。然而，目前關(guān)于VEC在CAVD進(jìn)程中的具體作用機(jī)制尚未達(dá)成共識。

綜上所述，本研究探討了通過膠原酶從豬主動脈瓣分離獲取VEC的方法，該方法實(shí)施方便，分離得到的VEC純度良好，有助于體外研究VEC在CAVD中的作用及機(jī)制。