干細(xì)胞移植治療血栓閉塞性脈管炎的療效判定

劉 浩 方 圓 潘天岳 方 剛 蔣小浪 魏 征 顧史洋陳 斌 蔣俊豪 石 赟 郭大喬 徐 欣 楊 玨 史振宇竺 挺 劉 彭 虞 奮 董智慧 符偉國

1 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院血管外科，上海 200032 2 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院血液科，上海 200032

血栓閉塞性脈管炎（thromboangiitis obliterans，TAO），也稱為Buerger 病，是一種節(jié)段性非硬化性炎性疾病，TAO 主要累及四肢的中小動脈及靜脈，導(dǎo)致重度肢體缺血（critical limb ischemia，CLI）甚至壞死[1]。TAO 好發(fā)于年輕人，尤其是年齡小于45 歲的男性，也可在女性中發(fā)病。吸煙在TAO 的起病及進(jìn)展中均起到重要作用，是其最重要的危險因素[1]。在一項回顧性研究中，110 名經(jīng)過旁路手術(shù)等傳統(tǒng)方法治療的TAO 患者的截肢率高達(dá)43%[2]。由此可見，TAO 所導(dǎo)致的肢體和勞動力喪失對于患者及其家庭及社會造成的打擊和負(fù)擔(dān)非常沉重。2002 年，Tateishi 等[3]首先報導(dǎo)了移植骨髓單個核細(xì)胞治療CLI；2009 年，Kawamoto 等[4]首次報導(dǎo)了移植純化CD34+細(xì)胞治療TAO 導(dǎo)致的CLI，并取得了滿意的結(jié)果。2009 年4 月，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院血管外科開始了關(guān)于CD34+細(xì)胞移植治療CLI 的臨床探索，并取得了理想的初期結(jié)果[5]。

迄今為止，在中心接受自體干細(xì)胞移植的患者已超過160 余名。研究報道自體純化CD34+細(xì)胞移植（autotransplantation of purified CD34+cells，ATPCC） 治療血管炎導(dǎo)致的重度肢體缺血（angiitis-induced critical limb ischemia，AICLI）的近、中、遠(yuǎn)期療效[6-7]，表明ATPCC 治療AICLI 的可行性，安全性及有效性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2014 年4 月至2016 年12 月接受ATPCC 的23 名TAO 患者術(shù)前及術(shù)后隨訪情況。納入和排除標(biāo)準(zhǔn)[5-6]，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）18～80 歲男性或女性；（2）中重度肢體缺血（盧瑟福4～5 分）；（3）病程＞4 周；（4）旁路手術(shù)或腔內(nèi)手術(shù)不可行；（5）若存在潰瘍，經(jīng)4 周的規(guī)范治療后未痊愈。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）3 月內(nèi)發(fā)生過心血管事件、肺栓塞及重度肝腎功能異常等健康事件；（2）增殖性視網(wǎng)膜病變；（3）預(yù)期壽命＜1 年；（4）禁忌使用重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF）。在隨訪不同時期，比較不同指標(biāo)變化規(guī)律及特點，總結(jié)并歸納出在TAO 治療的不同時期采用何種指標(biāo)進(jìn)行療效判定。

1.2 方法

粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）動員5 日，期間每日皮下注射低分子肝素1 支（4100 IU）并檢查外周血細(xì)胞計數(shù)。第5 日晨G-CSF皮下注射后行血常規(guī)及CD34+流式細(xì)胞（FACS）檢測，靜脈注射葡萄糖酸鈣及地塞米松5 mg。采集、分選后，苔盼藍(lán)染色檢測純化終產(chǎn)物細(xì)胞活力，F(xiàn)ACS 檢測CD34+細(xì)胞純度。全麻下分點肌肉注射純化產(chǎn)物，患者術(shù)后長期服用阿司匹林和和西洛他唑[7-9]。

1.3 觀察指標(biāo)

所有患者術(shù)后1、2、3、6 及12 月定期隨訪，之后每12 月隨訪一次（圖1）。術(shù)后所觀察的指標(biāo)包括療效性指標(biāo)和安全性指標(biāo)。主要療效性指標(biāo)包括：總無截肢生存率（total amputation free survival rate，TAFS）及主要無截肢生存率（major amputation free survival rate，MAFS）；次要療效性指標(biāo)包括：踝肱指數(shù)（ankle-brachial index，ABI）、趾肱指數(shù)（toe-brachial index，TBI）、經(jīng)皮氧分壓（transcutaneous partial oxygen pressure，TcPO2）、 無痛步行時間（pain-free walking time, PFWT）（2.5 km/h，坡度10°）、Wong-Baker 疼痛評分（Wong-Baker FACES pain rating scale score，WBFPS）、復(fù)發(fā)及再發(fā)、潰瘍愈合率、生活質(zhì)量評分（quality of life, QOL）及勞動力恢復(fù)率。其中QOL 是通過使用SF-36 v2 量表八個模塊（生理機(jī)能、生理職能、軀體疼痛、一般健康狀況、精力、社會功能、情感職能和精神健康）中生理機(jī)能和一般健康狀況來定期評估患者的術(shù)前及術(shù)后生活質(zhì)量[10]。安全性指標(biāo)包括觀察患者自動員開始至移植后2 周內(nèi)所發(fā)生的所有不良事件及全因病死率、病理性血管新生及移植后白細(xì)胞持續(xù)性增高。復(fù)發(fā)定義為移植側(cè)肢體再次發(fā)生CLI，再發(fā)定義為非移植側(cè)肢體發(fā)生CLI。

圖1 患者隨訪期間流程圖

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（x±s）表示，組內(nèi)比較采用配對t檢驗；計數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗，P＜0.05 時為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

23 例TAO 患者，均為男性，年齡24～54 歲，平均（41.1±10.1）歲。20 名患者具有主動吸煙史。術(shù)前盧瑟福分級，1 名患者為4 級，22 名為5 級，所有患者術(shù)前均因疼痛或壞疽喪失勞動能力。截止到2019 年10 月，23 例患者中1 例失訪，1 例患者于術(shù)后27 個月因心臟疾病死亡，21 例患者規(guī)律隨訪34～66 月，平均隨訪時間（46.7 ± 10.2）月。共治療23 條肢體，其中22 條下肢，1條上肢，平均移植CD34+細(xì)胞量（6.5 ± 6.1）×105/kg，苔盼藍(lán)染色測細(xì)胞活力97.65%～99.50%，平均活力（98.30±0.67）%，所有患者都取得了技術(shù)的成功。

2.2 臨床療效

2 例患者于移植術(shù)中行Ⅰ期清創(chuàng)，5 例患者于移植后6 月內(nèi)行Ⅱ期清創(chuàng)截趾，無患者于移植后行踝上截肢。

2.2.1 WBFPS 比較

WBFPS 評分，移植后24 個月（1.17±2.29）分和移植后1 個月（7.24 ± 2.91）分均低于移植前（8.20±1.83）分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。

2.2.2 血液灌注指標(biāo)比較

移 植 后12 個 月ABI（0.586 ± 0.247）高 于 移 植 前（0.472±0.254），差 異 有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義（P＜0.05，圖3A）。移植前4 例患者因足趾潰瘍或壞疽不能行TBI 檢查，19 例患者移植前TBI 為（0.117±0.155），移植后各時間點TBI 均高于移植前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3B）。移植后2 和3 個月的TcPO2與移植前（20.60±13.70）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3C）。

2.2.3 功能指標(biāo)比較

23 例患者術(shù)前盧瑟福分級均≥4 級，所有患者移植前均存在靜息痛。靜息痛平均緩解時間為（5.43±8.25）周。移植前23 名患者的PFWT 為（308.8±430.3）s（10例患者因足底潰瘍或疼痛等原因無法行走），移植后1、6、12、24 及36 個月的PFWT 分別為（160.3±75.4）s、（593.3±449.4）s、（870.6±429.8）s、（922.2±521.9）s及（1010.0±417.4）s，與移植前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3D）。

2.2.4 潰瘍愈合率、總無截肢生存率和主要無截肢生存率比較

移植前95.65%（22/23）患者存在潰瘍，移植后6、12 月、24 和36 個月的潰瘍愈合分別為54.55%（12/22）、72.73%（16/22）、95.45%（21/22）和95.45%（21/22），與移植前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

移植后6 個月，6 例患者因感染等原因行截趾術(shù)；移 植 后6、12、24 及36 個 月 的MAFS 分 別 為95.65%（22/23）、95.65%（22/23）、95.65%（22/23）及91.30%（21/23）；TAFS 分 別 為73.91%（17/23）、73.91%（17/23）、73.91%（17/23） 及69.57%（16/23）。（ 圖4A-B）

2.3 復(fù)發(fā)/再發(fā)

圖2 隨訪期間TAO 患者WBFPS 評分

圖3 血液灌注恢復(fù)和功能改善指標(biāo)變化

圖4 隨訪期間TAO 患者的MAFS 及TAFS

3 例患者4 條下肢在移植后發(fā)生復(fù)發(fā)/再發(fā)，第1 例患者移植后8 個月再發(fā)，18 月復(fù)發(fā)，雙下肢均表現(xiàn)為間跛；第2 和3 例患者分別于移植后21 個月及35 個月再發(fā)，分別表現(xiàn)為靜息痛及間跛。第1 和2 例患者移植后因靜息痛緩解再次吸煙，第3 例患者移植后因工作原因長期吸入二手煙。

3 例患者復(fù)發(fā)/再發(fā)后行藥物治療并強(qiáng)調(diào)戒煙或避免接觸二手煙，后第1 和2 例患者癥狀均緩解，無需再次行干細(xì)胞移植干預(yù)；第3 例患者因間跛癥狀持續(xù)不改善，發(fā)展至靜息痛甚至壞疽，于右下肢移植45 個月后再次行左下肢干細(xì)胞移植，患者左下肢術(shù)移植8 個月就診于整形科行左足截趾，現(xiàn)左下肢術(shù)后9 個月，靜息痛及間跛癥狀消失（圖5）。

移植后1～3 個月，23 例患者的盧瑟福分級與移植前比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；移植后6～36 個月與移植前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖6）。

盧瑟福分級0～3 級患者為非CLI，移植前，非CLI狀態(tài)所占比例為0%（0/23），移植后6 個月為47.83%（11/23），24 個月時達(dá)到頂峰78.26%（18/23）（圖6）。

圖5 1 例再發(fā)患者的足部隨訪照片

圖6 隨訪期間TAO 患者盧瑟福分級分布

2.4 生活質(zhì)量比較

23 例患者術(shù)前均因疼痛或潰瘍喪失勞動能力，移植后除去失訪1 例及死亡1 例，余21 例患者全部恢復(fù)勞動能力，重返社會崗位。移植后12 個月及36 個月的QOL 的生理機(jī)能和一般健康狀況均優(yōu)于移植前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（圖7A-H）

2.5 安全性指標(biāo)

23 例患者，自動員開始至移植后2 周內(nèi)均未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)及死亡事件；細(xì)胞移植及隨訪期間也未發(fā)現(xiàn)任何諸如眼底血管新生等病理性血管新生事件；隨訪期間的化驗結(jié)果證實了無移植后白細(xì)胞持續(xù)性增高。

3 討論

TAO 作為一項好發(fā)于中青年男性的炎性疾病，其病理特征諸如中小血管累及、炎性浸潤及血管彈力層完整等[6]決定了其經(jīng)傳統(tǒng)手術(shù)及腔內(nèi)治療療效不佳，旁路術(shù)后1、5 和10 年的Ⅰ期通暢率分別41%、32%和30%，Ⅱ期通暢率54%、47%和39%[11-12]；經(jīng)長期治療后，TAO截肢風(fēng)險在確診5 年后為25%，10 年后為38%，20 年后為46%[13-14]；42 歲前勞動力喪失率高達(dá)34.8%[11-12]?？梢姡琓AO 對家庭及社會均帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，因此，對于TAO找到適合的治療方法及對治療方式的療效進(jìn)行及時、有效的判定就顯得至關(guān)重要。

TAO 患者就診時最常見的主訴為疼痛，因此，疼痛相關(guān)指標(biāo)如WBFPS 及PFWT 應(yīng)是早期療效所關(guān)注的重點。本研究中，23 例患者疼痛緩解時間集中在2 周左右，在移植后第一次隨訪（移植1 個月）時WBFPS 較移植前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，在移植6 個月進(jìn)入“平臺期”，之后保持在一個相對穩(wěn)定的水平。PFWT 是指患者在2.5 km/h，坡度為10°的運動平板上所能行走的最長時間（21 min為檢查所設(shè)定的最長時間），相對于WBFPS，PFWT 是一種功能性測試，一定程度上可以反映患者行走功能的恢復(fù)情況[15]。移植前，10 例患者因疼痛或潰瘍等原因無法進(jìn)行測試，記為0 s，移植1 個月，10 例患者中已有6 例可以進(jìn)行測試，自移植后，PFWT 與移植前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。移植12 個月PFWT 進(jìn)入“平臺期”，移植36 個月，已有15 例患者的PFWT 達(dá)到21 min。因此，WBFPS 及PWFT 可以作為TAO 治療療效的早期（12 月內(nèi)）判定指標(biāo)。

圖7 移植前、移植后12 個月及36 個月的QOL 評分

相對于以上兩項指標(biāo)，本研究中盧瑟福分級在移植6個月后與移植前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，還有文獻(xiàn)報道盧瑟福分級在12 個月才出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異[5]，后持續(xù)改善至移植24 個月并保持穩(wěn)定。因此，盧瑟福分級及相應(yīng)的非CLI 比例作為評價患者肢體缺血等級的指標(biāo)，應(yīng)當(dāng)用在對TAO 中遠(yuǎn)期療效評估當(dāng)中。

在反映血流灌注的ABI、TBI、TcPO2 等指標(biāo)方面，ABI 僅在移植6、12 個月與移植前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，TcPO2在隨訪的任何時期與移植前比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而TBI 自移植2 個月起就與移植前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示TAO 治療后TBI 的改變與患者癥狀的緩解可能要比ABI 和TcPO2更加符合，TBI 這一指標(biāo)的引入避免了遠(yuǎn)端病變情況下ABI 判定的不足。

TAO 患者的5 年生存率為97%，要遠(yuǎn)高于下肢動脈粥樣硬化患者[16]，而且平均年齡較輕[17]，42 歲前勞動力喪失率高達(dá)34.2%[11]。因此其對于療效的要求通常停留在挽救肢體，也期待著改善其活動能力，重返勞動崗位。對患者移植前后的QOL 采用SF-36 v2 量表進(jìn)行評估，移植36 個月，除去失訪1 例及死亡1 例，69.57%的患者能夠重新開始工作，26.1%的患者甚至能夠從事相對重體力勞動，這不僅對于TAO 患者來說意義尤為重大，對于社會也有積極的意義。

除了治療方法的有效性外，持久性也是應(yīng)重點關(guān)注的一方面。移植36 個月的MAFS 及TAFS 分別為91.30%和69.57%，與Kondo 等[16]報道相似，表明ATPCC 在保肢方面取得了理想的中遠(yuǎn)期結(jié)果。復(fù)發(fā)及再發(fā)方面，3 例患者的3 條下肢再發(fā)，1 條肢體再發(fā)，復(fù)發(fā)/再發(fā)時間多集中在1～2 年期間。吸煙作為TAO 目前已知的最重要的危險因素[1]，復(fù)發(fā)/再發(fā)的3 例患者中2 例術(shù)后未能完全戒煙，1 例術(shù)后因工作原因長期接觸二手煙，因此強(qiáng)調(diào)戒煙/避免二手煙應(yīng)作為患者術(shù)后不應(yīng)忽視的注意事項。移植前22 例患者有不愈潰瘍，6 月潰瘍愈合率為54.55%，至36 月潰瘍愈合率逐步上升至95.45%（1 人失訪，按潰瘍不愈處理）。

ATPCC 在治療TAO 方面表現(xiàn)出了安全有效的近、中、遠(yuǎn)期療效。通過這一研究，提示在TAO 治療后的近期及中遠(yuǎn)期應(yīng)著重觀察不同的指標(biāo)，WBFPS 及PFWT 作為早期出現(xiàn)改變后進(jìn)入平臺期的指標(biāo)，應(yīng)作為早期觀察的重；盧瑟福分級作為較晚出現(xiàn)改變的指標(biāo)，應(yīng)當(dāng)作為TAO 治療后中遠(yuǎn)期觀察的指標(biāo)。針對療效持久性方面，復(fù)發(fā)/再發(fā)率可以作為較客觀的指標(biāo)。另外，針對患者的特點，QOL 及勞動力復(fù)發(fā)率無論是對于患者本人、家庭甚至是社會都具有重要意義。本研究病例數(shù)尚少，有待大規(guī)模前瞻性對照臨床研究提供更為有力證據(jù)。