乳酸菌對紅曲黃酒釀造過程酵母菌生長及風(fēng)味物質(zhì)形成的影響

洪家麗 陳 敏 周文斌 郭偉靈 李 路 黃梓芮 劉 斌 白衛(wèi)東 倪 莉 饒平凡 呂旭聰，3*

（1 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 福州 350002

2 福州大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)研究所 福州 350108

3 福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心 福州 350002

4 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院 廣州 510225）

黃酒是我國的傳統(tǒng)發(fā)酵酒，具有幾千年的歷史和獨特的工藝，與啤酒、葡萄酒并被譽為“中華國粹”[1]。紅曲黃酒因添加了紅曲進行發(fā)酵而具有與眾不同的功效[2]。酵母菌是釀酒過程中最重要的微生物之一，酵母菌主要通過對糖分解、轉(zhuǎn)化或同化淀粉和糊精，產(chǎn)生乙醇，同時代謝產(chǎn)酸和脂類物質(zhì)，其數(shù)量變化對黃酒品質(zhì)有很大影響[3-4]。紅曲黃酒香氣成分復(fù)雜，主要產(chǎn)生于發(fā)酵過程中，由于霉菌和酵母菌等微生物代謝的產(chǎn)物或微生物之間相互作用，產(chǎn)生揮發(fā)性香氣成分[5-6]。這些成分在黃酒中所占比例極微，然而對風(fēng)味有較大影響[7]。黃酒傳統(tǒng)釀造除了霉菌和酵母菌外，還有大量細(xì)菌參與，如：麥曲黃酒具有特殊的曲香，酒中氨基酸含量較高，這與麥曲中細(xì)菌菌群分泌的酶及其代謝產(chǎn)物有密切聯(lián)系[8]。細(xì)菌對酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成的影響主要通過兩個途徑：一是細(xì)菌自身產(chǎn)酯酶，通過酯酶的催化作用影響揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的生成[9]；二是細(xì)菌通過與酵母菌間的相互作用影響其發(fā)酵代謝活性[10]。乳酸菌在黃酒釀造過程中除產(chǎn)生乳酸外，還以乳酸為底物產(chǎn)生乙酸、琥珀酸等其它有機酸，而這些有機酸通過酯化反應(yīng)生成相應(yīng)的乙酯類化合物，這些乙酯類化合物恰恰是黃酒中重要的香氣物質(zhì)[11]。目前，對于黃酒中霉菌和酵母菌的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究較多[12-13]，而對于乳酸菌對紅曲黃酒釀造過程中酵母菌生長及風(fēng)味物質(zhì)形成的影響鮮有報道。

課題組前期從酒曲和傳統(tǒng)釀造過程中分離鑒定出6種乳酸菌。本文主要考察了不同乳酸菌對紅曲黃酒釀造過程中酵母菌生長及風(fēng)味物質(zhì)形成的影響。采用純種多菌混合發(fā)酵方法，構(gòu)建微生物共培養(yǎng)釀造體系，應(yīng)用熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)跟蹤發(fā)酵過程中酵母菌的動態(tài)變化，利用高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）等技術(shù)測定發(fā)酵過程中各種理化指標(biāo)和風(fēng)味物質(zhì)的變化，進一步深入研究不同乳酸菌對紅曲黃酒釀造過程中風(fēng)味物質(zhì)形成的貢獻，從而推測發(fā)酵過程中的微生物與風(fēng)味物質(zhì)變化的內(nèi)在聯(lián)系，篩選出潛在可應(yīng)用于釀造紅曲黃酒的優(yōu)良乳酸菌菌株。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

所用微生物菌株均為課題組前期從紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造用曲和釀造過程中分離純化鑒定獲得。乳酸菌菌株包括巴氏葡萄球菌（Sp）、腸膜明串珠菌（Lm）、戊糖片球菌（Pp）、乳酸乳球菌（Ll）、植物乳桿菌（Lp）和干酪乳桿菌（Lc）；真菌菌株包括紫色紅曲霉（Mp）、米根霉（Ro）和釀酒酵母（Sc）。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI Step One Plus型RT-qPCR儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；D-2000日立LaChorm Elite高效液相色譜儀，日立高新技術(shù)公司；HP GC6890N-MSD5975氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司；PB-10 pH計，德國賽多利斯公司；HP GC6890N-MSD5975型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基 MRS肉湯培養(yǎng)基：將6株乳酸菌接種于滅菌過的MRS肉湯培養(yǎng)基；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：將紅曲霉和米根霉接種于滅菌過的PDA培養(yǎng)基；酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培養(yǎng)基：將釀酒酵母接種于滅菌過的YPD培養(yǎng)基。

1.3.2 純種多菌混合釀造工藝

圖1 純種多菌混合釀造工藝流程圖Fig.1 Process flow diagram of mixed-cultures fermentation

1.3.3 乳酸菌強化發(fā)酵體系的構(gòu)建 以紅曲霉（106個/g 糯米）+米根霉（106個/g 糯米）+釀酒酵母（106個/g糯米）為基礎(chǔ)發(fā)酵體系，在此基礎(chǔ)上分別接種不同乳酸菌（104個/g糯米）進行強化發(fā)酵，以不添加任何乳酸菌為空白對照，共7個體系，分別是巴氏葡萄球菌（Sp）體系、戊糖片球菌（Pp）體系、腸膜明串珠菌（Lm）體系、乳酸乳球菌（Ll）體系、植物乳桿菌（Lp）體系、干酪乳桿菌（Lc）體系及空白（C）體系。

1.3.4 酵母菌基因組DNA提取和純化 酵母菌基因組DNA的提取采用氯化芐法[14]，提取后的DNA溶液經(jīng)過磁珠法[15]純化后，于-20℃冰箱保存。

1.3.5 熒光定量PCR分析 使用SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）試劑盒，采用特異性引物對樣品酵母菌的DNA進行qPCR檢測，qPCR的反應(yīng)體系為20μL，擴增體系的配制及操作流程參考試劑盒說明書。

表1 釀酒酵母實時熒光定量PCR特異性引物及其擴增條件Table1 RT-qPCR primers and amplification condition

1.3.6 還原糖和乙醇含量的測定 發(fā)酵樣品中還原糖的測定參考文獻[5]的方法；采用氣相色譜法測定乙醇含量[5]。

1.3.7 有機酸的測定方法 采用高效液相色譜法檢測發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸和乙酸含量[17]。色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（5μm×4.6mm×250mm）；流動相為0.02mol/L KH2PO4-乙腈（98：2），用磷酸調(diào) pH值至2.3；流速 1.0mL/min；紫外檢測波長：210 nm；柱溫：30℃；進樣量：20.0μL。

1.3.8 總酸測定 測定方法參照國標(biāo)《黃酒》（GB/T 13662-2008）[18]。

1.3.9 GC-MS分析 將萃取頭從頂空瓶中取出，迅速插入氣相色譜儀進樣口，在溫度250℃下解吸5min，進行GC-MS檢測分析。

氣相色譜（GC）條件：高純氦氣作為載氣，流速：1 mL/min；DB-Wax色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），不分流進樣，進樣口溫度250℃；起始溫度40℃，保持5min，以5℃/min升至120℃，然后以10℃/min升至240℃，保留5min；后運行溫度240℃，后運行時間 5min；質(zhì)譜（MS）條件：接口溫度280℃；連接桿溫度150℃；EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，質(zhì)量掃描范圍：m/z 35～450；ACQ 方式：Scan。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析 定性方法：通過檢出物質(zhì)譜圖和NIST11、Wiley中標(biāo)準(zhǔn)譜圖的比對檢索，以及與相關(guān)文獻[5，12，19-21]報道的香氣描述和保留指數(shù)相比較，確證所檢出紅曲黃酒香氣中的各種化學(xué)成分。采用HS-SPME法萃取時，對樣品分析應(yīng)扣除圖譜中由萃取頭生產(chǎn)的硅氧烷類雜質(zhì)峰，準(zhǔn)確地鑒定出4種紅曲黃酒中的揮發(fā)性風(fēng)味組分。定量方法：以2-辛醇（10mg/L）為內(nèi)標(biāo)進行分析，計算4種紅曲黃酒中的各種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)濃度。采用SIMCA14.1軟件，根據(jù)相關(guān)系數(shù)列出相關(guān)矩陣，并求出特征根及其相應(yīng)的特征向量。根據(jù)紅曲黃酒有關(guān)成分相對含量的標(biāo)準(zhǔn)化值及特征根、特征向量計算出各主成分值，并以此做主成分散點圖。用R語言軟件cor（）函數(shù)計算香氣成分與感官指標(biāo)的相關(guān)性系數(shù)，用gplots包做相關(guān)性熱圖。

1.3.11 感官分析 黃酒的感官評定標(biāo)準(zhǔn)主要為色澤、香氣、口味和風(fēng)格。具體的評定標(biāo)準(zhǔn)參考文獻[22]所述方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌對紅曲黃酒釀造過程酵母菌生長的影響

酵母菌是黃酒生產(chǎn)的關(guān)鍵，其生長的優(yōu)劣直接影響黃酒的品質(zhì)和出酒率。酵母菌在釀造過程中具有繁殖速度快，能夠在短期時間內(nèi)產(chǎn)生較多酒精，以抑制雜菌的生長，并有一定的后生長能力，可以有效增加酒產(chǎn)量，產(chǎn)生較多的風(fēng)味物質(zhì)[23]。由圖2可知，不同乳酸菌從發(fā)酵15 d開始對酵母菌影響各不相同，有些乳酸菌的存在會抑制釀酒酵母的生長，如接種干酪乳桿菌（Lc）后從發(fā)酵第15天開始乳酸菌數(shù)量大幅度減少。與不接種乳酸菌相比，接種不同乳酸菌在發(fā)酵后期對釀酒酵母的生長情況有較大影響。

圖2 不同乳酸菌對紅曲黃酒釀造過程酵母菌生長的影響Fig.2 Effects of different lactic acid bacteria on yeast growth in the fermentation of Hongqu glutinous rice wine

2.2 不同乳酸菌對紅曲黃酒理化指標(biāo)的影響

2.2.1 還原糖和乙醇 紅曲黃酒釀造中原料與酒曲微生物相互作用，原料中的淀粉可被降解和轉(zhuǎn)化為還原糖、醇類等影響黃酒品質(zhì)的物質(zhì)，因而釀造過程中的糖類和醇類的動態(tài)變化，尤其還原糖與乙醇含量可反應(yīng)微生物的代謝活動變化趨勢[24]。從圖3a可知，除接種干酪乳桿菌（Lc），在發(fā)酵第10天才達到最大還原糖量后，干酪乳桿菌（Lc）與其它不同乳酸菌對發(fā)酵過程中還原糖的變化趨勢大致相同，這說明接種干酪乳桿菌（Lc）對酵母菌發(fā)酵產(chǎn)還原糖影響不大。

由圖3b可知，接種戊糖片球菌（Pp）后乙醇含量在第15～20天處下降較明顯，可能是戊糖片球菌（Pp）轉(zhuǎn)化乙醇為酯、醛等化合物的速度較其它乳酸菌快。另外，在發(fā)酵第20～30天逐漸上升，這可能由于乳酸菌分解剩余淀粉和糊精提供給酵母發(fā)酵又促進酒精度升高。而接種腸膜明串珠菌（Lm）在發(fā)酵第10～15天乙醇的增量最小，說明腸膜明串珠菌（Lm）對釀酒酵母發(fā)酵還原糖產(chǎn)酒精有明顯的抑制作用。從第30天的乙醇含量來看，與空白（C）體系相比，添加不同乳酸菌菌株對釀酒酵母產(chǎn)酒精均有一定抑制作用，然而作用并不顯著。

圖3 還原糖和乙醇在不同釀造體系中的產(chǎn)量Fig.3 The yield of reducing sugar and ethanol in different brewing systems

2.2.2 有機酸 乳酸是黃酒中主要的有機酸，約占60%～70%，其次是乙酸和琥珀酸，還有少量的檸檬酸、草酸、酒石酸和酮酸等。乳酸具有降低釀造環(huán)境中pH值，抑制其它細(xì)菌和霉菌生長，并對黃酒的風(fēng)味有重要作用[25]。

由圖4可知，接種干酪乳桿菌（Lc）能有效提高乳酸含量達到最高，其次是植物乳桿菌（Lp）、戊糖片球菌（Pp）、腸膜明串珠菌（Lm）和乳酸乳球菌（Ll），研究表明一定量的乳酸具有防腐保鮮功效；接種不同乳酸菌均能有效提高乙酸的產(chǎn)量。己酸是一種刺激酸味，適量的乙酸能增強酒的風(fēng)味和品質(zhì)，而超過一定量時會引起酒的渾濁。

圖4 乳酸和乙酸在不同釀造體系中的產(chǎn)量Fig.4 The yield of lactic acid and acetic acid in different brewing systems

2.2.3 總酸 黃酒中的總酸和pH值直接影響黃酒風(fēng)味，其中總酸中大部分為有機酸。有機酸是黃酒中香氣和呈味成分，與其它香氣成分共同構(gòu)成黃酒獨特的芳香風(fēng)味。適量的有機酸有助于保持黃酒的香氣，并利于人體消化。酵母發(fā)酵產(chǎn)酒精和少量有機酸，乳酸菌則產(chǎn)生大量有機酸使總酸不斷上升。

本文對發(fā)酵第30天的總酸量進行測定。一般認(rèn)為酒液總酸度超過7 g/L，則稱為中度超酸。由圖5可知，接種干酪乳桿菌（Lc）后的總酸含量最高，由此可見，接種干酪乳桿菌（Lc）菌株后酒液出現(xiàn)中度超酸現(xiàn)象。由pH值的變化情況，可以發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌（Lp）和干酪乳桿菌（Lc）的pH值變化趨勢相似，在發(fā)酵第1～3天pH值大幅度下降，且pH值始終比其它體系低，這與乳酸的分析結(jié)果相一致，并且釀酒酵母菌菌數(shù)減少，可能是該體系產(chǎn)乳酸較其它體系多的緣故，使得酸度快速增加，釀酒酵母難以生長，菌數(shù)減少加快。

圖5 不同釀造體系中酒醪液的pH值變化情況和發(fā)酵終產(chǎn)物的總酸比較Fig.5 Change of pH and total acids in the end products of different brewing systems

2.3 不同乳酸菌對紅曲黃酒揮發(fā)性風(fēng)味組分的影響

構(gòu)成黃酒香氣的成分主要是醇類、醛類、酯類等羰基化合物，黃酒中醇類物質(zhì)主要是乙醇，其次是一些高級醇，賦予黃酒典型的醇香味[26]。黃酒中的酯類很豐富，是其香氣構(gòu)成的關(guān)鍵成分[27]。醛類是黃酒中“香”的協(xié)調(diào)成分，主要對黃酒的香氣起平衡協(xié)調(diào)的作用[28]。本文對發(fā)酵第30天的酒液中揮發(fā)性化合物進行研究。從接種不同乳酸菌的酒樣品中共檢測出35種共有揮發(fā)性物質(zhì)，主要包括醇類11種、酯類14種、醛類5種、酸類5種和其它2種。

圖6 不同釀造體系發(fā)酵終產(chǎn)物的揮發(fā)性香氣組分熱圖分析Fig.6 Heatmap analysis of volatile aroma constituent of its end products in different brewing systems

圖7a為揮發(fā)性組分的第一和第二主成分散點載荷雙標(biāo)圖，可以發(fā)現(xiàn)接種干酪乳桿菌（Lc）和乳酸乳球菌（Ll）的揮發(fā)性組分與空白體系有顯著差異。其中，接種乳酸乳球菌（Ll）分布在PCA雙標(biāo)圖的第一象限，與之密切相關(guān)的揮發(fā)性香氣化合物主要是乙醛、異丁醛、乙酸異丁酯和4-乙基愈創(chuàng)木酚；接種干酪乳桿菌（Lc）菌株分布在PCA雙標(biāo)圖的第二象限，與之密切相關(guān)的揮發(fā)性香氣化合物主要包括丁二酸二乙酯、乙酸、乳酸乙酯、2，3-丁二醇和辛酸。圖7b為揮發(fā)性組分的第一和第三主成分散點載荷雙標(biāo)圖，依舊可以看出接種干酪乳桿菌（Lc）和乳酸乳球菌（Ll）菌株的酒液確實具有獨特香氣組分，空白體系與其它6種體系有顯著差異。接種乳酸乳球菌（Ll）分布在PCA雙標(biāo)圖的第一象限，與之密切相關(guān)的揮發(fā)性香氣化合物主要是正丙醇、乙酸異丁酯、乙酸乙酯、2-苯乙醇和丁酸乙酯；接種干酪乳桿菌（Lc）菌株分布在PCA雙標(biāo)圖的第三象限，與之密切相關(guān)的揮發(fā)性香氣化合物主要包括乳酸乙酯、2，3-丁二醇、丁二酸二乙酯和己酸乙酯；而空白體系分布在PCA雙標(biāo)圖的第二象限，與之密切相關(guān)的揮發(fā)性香氣化合物主要為苯甲醛。

圖7 不同釀造體系的揮發(fā)性香氣組分主成分分析得分載荷雙標(biāo)圖Fig.7 Principal component analysis of the volatile aroma components in different brewing systems

綜合圖6和圖7可知，7種體系的揮發(fā)性成分的種類和含量存在顯著差別，且接種干酪乳桿菌（Lc）和乳酸乳球菌（Ll）對發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性風(fēng)味組分的影響更為顯著。這可能是由于接種不同乳酸菌菌株干擾了紅曲黃酒其它微生物的生長代謝，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物中揮發(fā)性風(fēng)味成分有顯著區(qū)別。

由圖8可知，接種不同乳酸菌能顯著增加草酸乙酯和苯甲酸含量，并降低正丁醇、苯甲醛和乙酸異戊酯含量。接種不同乳酸菌的體系產(chǎn)生揮發(fā)性組分也存在差異性，如接種干酪乳桿菌（Lc）和植物乳桿菌（Lp）能顯著增加辛酸和乳酸乙酯的產(chǎn)量，接種乳酸乳球菌（Ll）能顯著增加辛酸乙酯、正丁醇和草酸乙酯的產(chǎn)量，而不接種乳酸菌的空白組能顯著降低苯甲醇的產(chǎn)量。因此，有必要對產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)與黃酒風(fēng)味和感官特性進一步的分析。

圖8 不同乳酸菌對紅曲黃酒中9種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)量的影響Fig.8 Effects of different lactic acid bacteria on the yield of volatile flavor compounds in Hongqu glutinous rice wine

2.4 不同乳酸菌對紅曲黃酒感官品質(zhì)的影響

對發(fā)酵30 d后的酒液進行感官品評分析，綜合評價6種不同乳酸菌對紅曲黃酒感官品質(zhì)的影響。由表2中可以看出，添加了戊糖片球菌（Pp）進行強化發(fā)酵的酒樣在各種感官指標(biāo)上明顯優(yōu)于其它組，而添加其它乳酸菌菌株的酒液的感官指標(biāo)均比空白體系低，尤其是添加干酪乳桿菌（Lc）的酒液得分最低。綜上，添加戊糖片球菌能夠提升其感官分析的各項指標(biāo)，而其它乳酸菌則相反。

表2 感官評定結(jié)果Table2 The results of sensory evaluation

由圖9可知，感官總分與正丁酸、苯乙醛、2-苯乙醇、乙酸異戊酯、正丙醇和1-壬醇具有正相關(guān)，與乙酸丁酯、辛酸、乳酸乙酯、葵酸乙酯、辛酸乙酯、正丁醇和5-甲基糖醛呈負(fù)相關(guān)。草酸乙酯、苯甲醛和乙酸與風(fēng)味和口味呈正相關(guān)，與香氣出現(xiàn)了相反的關(guān)系。

圖9 揮發(fā)性物質(zhì)與感官指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析Fig.9 Correlation analysis of volatile substances and sensory index

3 結(jié)論

研究接種不同乳酸菌對紅曲黃酒發(fā)酵中酵母菌、還原糖和乙醇產(chǎn)量的影響。可以發(fā)現(xiàn)，與空白體系相比，接種不同乳酸菌菌株在發(fā)酵后期對釀酒酵母的生長有較大影響，干酪乳桿菌（Lc）對釀酒酵母的生長出現(xiàn)明顯抑制作用，而其它體系都出現(xiàn)不同程度的促進作用。接種巴氏葡萄球菌（Sp）和戊糖片球菌（Pp）能有效提高酵母菌產(chǎn)還原糖能力，然而接種腸膜明串珠菌（Lm）、植物乳桿菌（Lp）和干酪乳桿菌（Lc）對酵母菌產(chǎn)還原糖具有抑制作用；從乙醇的終含量來看，雖然添加不同乳酸菌菌株對釀酒酵母產(chǎn)酒精有一定的抑制作用，但作用不顯著。

在接種不同乳酸菌菌株的紅曲黃酒中共檢測到34種主要揮發(fā)性成分，主要有醇類11種、酯類14種、醛類5種、酸類5種和其它2種。接種不同乳酸菌能顯著增加草酸乙酯和苯甲酸含量，并降低正丁醇、苯甲醛和乙酸異戊酯含量。接種干酪乳桿菌（Lc）能顯著增加辛酸和乳酸的產(chǎn)量，而接種乳酸乳球菌（Ll）能有效增加辛酸乙酯和正丁醇揮發(fā)性物質(zhì)。并發(fā)現(xiàn)正丁酸、苯乙醛、2-苯乙醇、乙酸異戊酯、正丙醇和1-壬醇與感官總分呈正相關(guān)，乙酸丁酯、辛酸、乳酸乙酯、葵酸乙酯、辛酸乙酯、正丁醇和5-甲基糖醛與感官總分呈負(fù)相關(guān)；草酸乙酯、苯甲醛和乙酸與風(fēng)味和口味呈現(xiàn)正相關(guān)，與香氣出現(xiàn)了相反的關(guān)系。

戊糖片球菌的添加能夠提升酒液感官分析的各項指標(biāo)，其它乳酸菌則相反，尤其是植物乳桿菌或干酪乳桿菌的添加均會對紅曲黃酒釀造體系有著不利影響。因此，戊糖片球菌是潛在的可以應(yīng)用于釀造紅曲黃酒的優(yōu)良乳酸菌菌株。