MTGase點修飾改性提高小麥醇溶蛋白的乳化穩(wěn)定性

鄒 琳 楊 盛 李 陽 張 希 馮鳳琴

（浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品采后處理重點實驗室浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點實驗室 杭州 310058）

小麥醇溶蛋白是分子質(zhì)量為30～70 ku的單體蛋白質(zhì)[1]，是谷朊粉的主要組分，能賦予面團一定的延展性[2-3]。由于分子結(jié)構(gòu)中大量存在的亮氨酸、脯氨酸等非極性氨基酸殘基和不可解離的極性谷氨酰胺殘基，小麥醇溶蛋白在中性條件下主要以大的聚集體而非以單個分子存在[4]，溶解性較差，極大地限制了其在食品工業(yè)領域的應用。對小麥醇溶蛋白進行改性，增加其溶解性，提高乳化性、黏合性、熱穩(wěn)定性等功能性質(zhì)，拓寬小麥醇溶蛋白的應用，已成為當前研究的熱點。目前，主要采用物理法、化學法、酶法和基因工程法等對小麥醇溶蛋白進行改性[5]。物理法作用有限且不可控；化學法雖可有效提高小麥醇溶蛋白的性能，但可能會帶來毒副作用，如谷朊粉用堿處理后，其蛋白質(zhì)分子中的氨基酸發(fā)生消旋，導致必需氨基酸的L-對映體減少且消化率降低，并產(chǎn)生有毒的D-氨基酸，從而大大降低谷朊粉的營養(yǎng)價值[6]；基因工程法周期長，見效慢，目前應用并不多。相比之下，酶法改性條件溫和，具有可控性、高效性、低能耗等優(yōu)點。

微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（Microbial transglutaminase，MTGase）是一種通過微生物發(fā)酵、分離純化而制得的高效生物催化劑，具有成本低，作用溫度穩(wěn)定，pH值范圍廣，且不依賴鈣離子等優(yōu)勢[7-8]。其催化機理是以肽鏈中的谷氨酰胺殘基γ-甲酰胺基為?；w，與?；荏w發(fā)生交聯(lián)反應[9-10]，改善蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性、乳化性、凝膠性和持水性等功能性質(zhì)[11]。小麥醇溶蛋白分子中富含MTGase作用的良好底物谷氨酰胺[12]，這使得利用MTGase點修飾改性小麥醇溶蛋白具有可行性。Gerrard等[13]用SE-HPLC分析對比MTGase點修飾前、后面筋蛋白的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)面團中醇溶蛋白的含量明顯增加，而麥谷蛋白的變化并不明顯。倪新華等[14]應用MTGase對面粉進行品質(zhì)改良研究，結(jié)果表明，MTGase可以增加面團的形成時間、穩(wěn)定時間、斷裂時間，降低面團的弱化度，從而明顯改善面團的粉質(zhì)特性。由于小麥醇溶蛋白水溶性極差，因此在進行MTGase點修飾反應前需要進行一定的預處理打斷或展開其蛋白結(jié)構(gòu)，以暴露更多的反應位點[15]。Wróblewska 等[16]在進行 MTGase酶催化乳清蛋白點修飾反應前，先應用堿性蛋白酶對乳清蛋白進行水解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水解后的乳清蛋白更易于發(fā)生點修飾反應。

本研究以小麥醇溶蛋白的胃蛋白酶水解產(chǎn)物為底物，利用MTGase進行點修飾，以點修飾產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性為指標，探究3種外源氨基供體——甘氨酸乙酯（Ethylglycinate，Gly-O-Et）、6-氨基己酸（6-epsilon-aminocaproic acid，EACA）和乙醇胺（Monoethanolamine，MEA）對點修飾的調(diào)控作用，最后通過分析點修飾產(chǎn)物的熔融溫度、粒徑、電位和三相接觸角等理化性質(zhì)進一步確認點修飾改性對小麥醇溶蛋白底物乳化穩(wěn)定性的改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷朊粉，河南蓮花味精股份有限公司，蛋白質(zhì)含量76.02%。

甘氨酸乙酯鹽酸鹽（Gly-O-Et·HCl）、6-氨基己酸（EACA）、乙醇胺（MEA）和豬源胃蛋白酶，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；MTGase，泰興市東圣食品科技有限公司；4-二甲氨基偶氮苯磺酰氯（Dabsyl-Cl，CAS：56512-49-3），上海百靈威科技有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 儀器與設備

超聲波破碎儀，上海生析超聲儀器有限公司；自動凱氏定氮儀，瑞典福斯公司；反相高效液相色譜（RP-HPLC），美國安捷倫科技有限公司；差示掃描熱量儀，瑞士梅特勒-托利多公司；接觸角測量儀，德國Dataphysics公司；真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；粒徑分析儀，英國馬爾文公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 小麥醇溶蛋白的提取 將100mL乙醇檸檬酸緩沖溶液放入60℃水浴鍋預熱2min后，啟動磁力攪拌，緩慢加入50 g/L的谷朊粉，保溫攪拌30min后，20 kHz，150W 超聲處理 30min。處理后的懸濁液在2 000 r/min，12℃條件下離心10 min。取上清液4℃保存。

將上清液緩慢加到水中，制備得到體積分數(shù)12.5%蛋白乙醇水懸液。減壓旋蒸后，采用凱氏定氮法測定小麥醇溶蛋白粗提物（Wheat gliadin crude extracts，EXTs）的蛋白得率。

1.3.2 MTGase點修飾反應 將EXTs和0.01 mol/L HCl溶液按照體積比1∶4混勻，得到終質(zhì)量濃度為6.4 g/L EXTs懸濁體系。40℃恒溫攪拌下，以酶底物質(zhì)量比為1∶64添加胃蛋白酶進行水解。將水解0，0.5，1 h的粗提物100℃滅酶10min后，以相同濃度分別添加4 g/L甘氨酸乙酯鹽酸鹽，3.8 g/L 6-氨基己酸和0.17%（體積分數(shù)）乙醇胺，調(diào)節(jié)pH值至7.5。55℃恒溫攪拌下，以酶底物質(zhì)量比為1∶64添加 MTGase，分別在反應 1，2，4 h時取樣，85～100℃滅酶10min。

1.3.3 利用RP-HPLC測定氨基供體反應量點修飾產(chǎn)物過0.22μm有機濾膜后用蒸餾水稀釋10倍，取0.2mL稀釋過濾液與0.2mL碳酸鈉緩沖液（pH 9，0.05 mol/L Na2CO3∶0.1 mol/L NaHCO3=1∶9）混合均勻，再加入0.8mL 15mmol/L 4-二甲氨基偶氮苯磺酰氯乙腈反應液，混勻，在72℃水浴條件下反應15min，再加入1.2mL pH值為6.5的終止液（40mmol/L磷酸緩沖液∶無水乙醇=1∶1），置于10 000 r/min條件下離心10min，取上清液過0.22μm有機膜后用于檢測。

取濾液10μL進行檢測：C18柱溫維持40℃，波長 436 nm，流動相 A（乙腈）與流動相 B（0.2%HAC水溶液）的比例維持7∶3，流速0.6 mL/min，持續(xù)15min。計算公式如下：

式中，LN，x——反應x h后氨基供體殘留量，g；LN，0——反應前氨基供體添加量，g。

1.3.4 點修飾產(chǎn)物乳化穩(wěn)定性分析 取3mL點修飾產(chǎn)物在4℃下10 000 r/min離心5min，去掉上清后加入3mL的5mmo/L檸檬酸緩沖液（pH 4）重懸沉淀，再加入 3mL大豆油，混勻，20 kHz，150W超聲乳化1min，得到底物質(zhì)量濃度為3.2 g/L的乳化體系。將制備的乳液靜置36 h記錄析出水層高度。乳液穩(wěn)定系數(shù)計算公式如下：

式中，Hw，36——靜置36 h時乳層高度，cm；He，0——靜置0 h時乳層高度，cm。

1.3.5 小麥醇溶蛋白點修飾產(chǎn)物特征分析 將滅酶后的點修飾產(chǎn)物均分成3份，10 000 r/min離心5min，取沉淀分別添加到等體積的pH 6.99純凈水、5mmo/L pH 3.30檸檬酸緩沖液和5mmo/L pH 8.01碳酸鈉緩沖液中，20 kHz，150W超聲破碎、分散沉淀1min，最后將復分散的懸濁體系冷凍干燥，用于后續(xù)分析?？瞻捉M為添加已滅活的MTGase的小麥醇溶蛋白微粒懸濁體系。

1.3.5.1 差示掃描量熱儀（DSC）分析 取點修飾產(chǎn)物及其對應空白組的凍干樣品分別置于40μL鋁坩堝中，沖壓封閉，線性升溫速率10℃/min，溫度從25℃升至250℃，氮氣流速50mL/min。

1.3.5.2 粒徑、電位分析 向點修飾產(chǎn)物及其對應空白組的凍干樣品加入19倍體積而pH值不同（為3.31，4.31，5.34，6.01，6.38，6.96和8.01）的5mmo/L緩沖液中，然后測定其粒徑及電位，連續(xù)相黏度為0.8872mPa·s，折射系數(shù)為1.450，室溫下測定。

1.3.5.3 三相接觸角分析 將點修飾產(chǎn)物及其對應空白樣品溶解于60%乙醇水溶液中，滴一滴在載玻片上，待其風干后測定，每次滴加1μL水相，拍照觀察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS statistics 22和Origin Pro 9.2軟件進行相關性和線性回歸處理分析。

2 結(jié)果分析

2.1 響應面優(yōu)化小麥醇溶蛋白提取工藝

在評價乙醇體積分數(shù)、檸檬酸緩沖液濃度和超聲時間3個單因素的基礎上，設計3因素3水平CCD響應面，考察各因素之間的交互作用對小麥醇溶蛋白提取的影響，試驗設計及結(jié)果見表1、表2。

表1 響應面試驗因素及其水平Table1 Factors and levels used in response surface analysis

表2 響應面試驗設計及結(jié)果Table2 Response surface design with experimental results

對試驗結(jié)果進行多元回歸擬合，得到EXTs蛋白得率（Y）關于乙醇含量（A）、檸檬酸緩沖液濃度（B）、超聲時間（C）的二次回歸方程為：

Y=81.08+1.21A-1.37B-0.96C-1.14AB-0.26AC+0.06BC-13.81A2-3.57B2-6.23C2+13.6AB2

表3模型方差分析結(jié)果表明，該模型極顯著（P＜0.001），失擬項不顯著（P=0.5613＞0.05），說明該模型擬合度好。同時，可以得到各因素對EXTs蛋白得率影響強弱順序為B（檸檬酸緩沖液濃度）、C（超聲時間）、A（乙醇體積分數(shù)）。

表3 EXTs蛋白得率的響應面二次模型方差分析Table3 Analysis of variance of regression equation of EXTs rate

通過EXTs蛋白得率的二次多項數(shù)學模型解逆矩陣，得出在乙醇體積分數(shù)為60%，檸檬酸緩沖液濃度為5mmo/L，超聲時間為29.67min的工藝條件下，EXTs蛋白最大得率為81.0476%。

2.2 MTGase點修飾反應對EXTs乳化穩(wěn)定性的影響

2.2.1 MTGase點修飾反應對氨基供體反應量的影響 小麥醇溶蛋白的復合改性可彌補單種改性方法改善功能性質(zhì)受到限制的缺點。在進行MTGase點修飾改性前，利用胃蛋白酶催化小麥醇溶蛋白內(nèi)肽鍵斷裂成小分子多肽，增加蛋白質(zhì)的水溶性[17]，暴露出更多點修飾反應的位點，提高點修飾反應的效率。胃蛋白酶水解時間和MTGase點修飾反應時間對不同氨基供體反應量的影響見圖1。

隨著點修飾反應時間的延長，不同水解時間的EXTs與Gly-O-Et的反應量不斷升高，由圖1a可知，反應至4 h后，水解 0，30，60min的EXTs分別與（57.39±8.68）%，（41.79±0.78）%和（64.06±8.74）%的Gly-O-Et反應，說明未水解和水解60 min的粗提物均比水解30min的粗提物更契合MTGase的反應位點。這可能是因為MTGase催化水解30min的粗提物中暴露的殘基之間產(chǎn)生了點修飾，進而減少了能夠與Gly-O-Et結(jié)合的位點。

由圖1b可知，不同水解時間的粗提物與EACA的反應量隨著點修飾時間的延長而不斷升高，其中，水解60min的粗提物與EACA反應的速度最快，其次是水解30min的粗提物和未水解的粗提物，這可能是因為水解時間越長，粗提物中暴露的反應位點越多。反應至4 h時，水解60min的粗提物與 EACA的反應量最高，為（42.18±1.42）%，其次是水解30 min和未水解的粗提物，分別為（16.09±3.62）%、（20.09±2.80）%。

圖1 點修飾時間對氨基供體反應量的影響Fig.1 Influence of cross-linking time towards the reacting amount of exogenous amino donors

由圖1c可知，水解30min的粗提物更易與MEA發(fā)生點修飾反應，這可能與MEA具有親水性的小分子結(jié)構(gòu)有關，能夠優(yōu)先進入MTGase的催化活性部位[18]，迅速與水解30min的底物進行反應，然而隨著點修飾反應的深入并達到4 h時，未水解、水解30min和水解60min粗提物點修飾的MEA反應量相當，分別達到（25.03±2.49）%、（24.19±4.15）%和（23.48±5.82）%。

2.2.2 MTGase點修飾反應對產(chǎn)物乳化穩(wěn)定性的影響 MTGase能夠催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間、蛋白質(zhì)和氨基酸之間發(fā)生點修飾反應[19]，而不同程度的點修飾作用得到的乳濁液的乳化穩(wěn)定性不同。胃蛋白酶水解時間和MTGase點修飾反應時間對產(chǎn)物乳化穩(wěn)定性的影響見圖2。

胃蛋白酶水解程度不同的粗提物在進行以Gly-O-Et為氨基供體的點修飾后，產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性變化趨勢不同。由圖2a可知，MTGase點修飾反應能夠提高未水解產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性，其中，點修飾反應2 h時有顯著的提高，可能是低程度的點修飾作用得到的乳濁液容易發(fā)生脂肪球的聚集合并，而高程度的點修飾反應的乳濁液由于連續(xù)相的黏度增大或者是吸附層發(fā)生的變化弱化了聚集作用[20]，具有較高的穩(wěn)定性。然而這種提高是有限的，將產(chǎn)物放置36 h后，未水解且進行點修飾2 h的試驗組乳化穩(wěn)定系數(shù)為（91.93±0.11）%，相比未水解且未進行點修飾的空白組乳液穩(wěn)定性（90.24±0.23%）而言僅僅提高了1.69%。而對于水解30min和水解60min粗提物的點修飾產(chǎn)物，其乳化穩(wěn)定性不再提高甚至出現(xiàn)明顯的抑制作用。這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因是小麥醇溶蛋白粗提物經(jīng)過胃蛋白酶酶解后，在水相界面上產(chǎn)生較多的多肽[21]，使得后續(xù)點修飾反應過快地進行，而阻礙了規(guī)則的蛋白結(jié)構(gòu)的形成[22]，同時MTGase點修飾后的粗提物，其蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)被打開，多肽鏈變得舒展，導致分子內(nèi)部諸多疏水區(qū)域暴露在水溶液中，最終因疏水作用而凝集發(fā)生沉降[23]，從而降低了產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性。

由圖2b可知，與水解30min和水解60min粗提物的點修飾產(chǎn)物相比，未水解的粗提物與EACA進行點修飾反應后產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性最好，且點修飾2 h和4 h與點修飾0 h相比顯著提高。然而，點修飾反應對乳化穩(wěn)定性的提升有限，放置36 h后，點修飾4 h的試驗組乳液穩(wěn)定系數(shù)是（99.19±0.16）%，相比未進行點修飾的空白組乳液穩(wěn)定性（96.94±0.80）%而言僅提高了2.25%。同時，對水解60 min粗提物進行點修飾明顯降低了產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性。

由圖2c可知，MEA點修飾反應1 h和2 h時，對未水解粗提物乳化穩(wěn)定性的提高最明顯，而點修飾4 h時降低了乳化穩(wěn)定性。同時，水解30 min和水解60min的粗提物隨著點修飾反應時間的延長，產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性逐漸增強。

圖2 水解時間對點修飾產(chǎn)物乳化穩(wěn)定性的影響Fig.2 Influence of hydrolyzing time towards the emulsion stability of cross-linking products

2.3 小麥醇溶蛋白點修飾產(chǎn)物特征分析

2.3.1 DSC分析 由表4可知，Gly-O-Et點修飾（133.74±1.50）℃對粗提物熔融溫度（135.3±3.97）℃影響不顯著，EACA點修飾后產(chǎn)物的熔融溫度上升了15.85℃，而MEA點修飾降低了產(chǎn)物的熔融溫度（97.51±2.87）℃。此外，Gly-O-Et和MEA點修飾產(chǎn)物的焓變顯著高于EXTs與EACA點修飾產(chǎn)物，這表明MEA點修飾降低了產(chǎn)物熔融變化及伸展蛋白結(jié)構(gòu)所消耗的能量，使得它最易分散從而獲得膠體特性，其次是Gly-O-Et點修飾產(chǎn)物，而EACA點修飾產(chǎn)物最難實現(xiàn)蛋白結(jié)構(gòu)的展開。Ramirez-Suarez等[24]用差示掃描量熱儀對面團進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，因為MTGase使面筋網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，進而增加了面筋蛋白的轉(zhuǎn)變焓，故蛋白質(zhì)在熱變形過程中斷開共價交聯(lián)所需要的熱量而增加。

2.3.2 粒徑、電位分析 蛋白微粒會隨著pH值的變化而變化，最終在其等電點pI處聚集沉淀，破壞了此前的均勻分散體系，導致不能測定其粒徑（d，nm）和分散系數(shù)（Particle dispersion index，PDI）。因此，本試驗設定不同pH值（從酸到堿）來探究不同氨基供體點修飾后對EXTs粒徑、PDI和電位的影響。

表5 點修飾對粒徑的影響Table5 Effect of cross-linking on micro particle radius

由表5可知，空白組及其點修飾產(chǎn)物的粒徑在 pH 5.34～6.96時均不可測。當 pH=3.31時，EACA點修飾產(chǎn)物的粒徑最大，而MEA點修飾產(chǎn)物的粒徑最小。當pH值提高至8.01時，3種氨基供體點修飾后均顯著增大了EXTs的粒徑，其中EACA點修飾產(chǎn)物粒徑最大，而3組點修飾產(chǎn)物間無顯著差異。這表明小麥醇溶蛋白粗提物在與MEA發(fā)生點修飾反應后，其微粒粒徑由堿性條件下最小轉(zhuǎn)變?yōu)樵谒嵝詶l件下最小。

表6 點修飾對PDI的影響Table6 Effect of cross-linking on PDI

由表6可知，當pH 4.31時，EACA點修飾產(chǎn)物的PDI迅速增大，且遠高于Gly-O-Et、MEA點修飾產(chǎn)物及空白組。隨著溶液體系變?yōu)槿鯄A性（pH 8.01）時，EACA點修飾產(chǎn)物的PDI依然顯著高于其它3組。這表明，EACA點修飾顯著擴大了EXTs的pI范圍。

由表7可知，在pH=3.31和pH=8.01時，EACA點修飾產(chǎn)物的電位均顯著小于Gly-O-Et、MEA點修飾產(chǎn)物以及空白組，這表明EACA點修飾后會削弱底物的靜電排斥作用，影響其pI，從而降低產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性。在相應的酸性條件下，MEA點修飾產(chǎn)物電位顯著小于空白組，而在堿性條件下，其電位與空白組無顯著差異，這說明引入羧基可能并不會增加，甚至可能減弱了底物的靜電相互作用。

表7 點修飾對電位的影響Table7 Effect of cross-linking on Zeta-ζ，Zeta-ζrefers to Zeta-potential

2.3.3 接觸角測定 三相接觸角（θ）是衡量顆粒表面潤濕性的直觀數(shù)據(jù)，是制備Pickering乳液固體微粒的重要指標。當θ≈90°時，顆粒吸附能最大，對應Pickering乳液最穩(wěn)定[25-26]。由圖3可知，3種氨基供體點修飾后，產(chǎn)物的接觸角均顯著增大，且EACA點修飾產(chǎn)物的接觸角最大，高達（91.77±1.42）°，其次是MEA、Gly-O-Et。這表明與 Gly-OEt和MEA相比，EACA點修飾反應有效改善了小麥醇溶蛋白粗提物顆粒的表面潤濕性，這種差異出現(xiàn)的原因可能是EACA在MTGase催化的點修飾反應過程中隨機地或有選擇性地與一些親水或疏水性蛋白片段位點結(jié)合，從而直接影響了產(chǎn)物的親水或疏水性。

圖3 點修飾對接觸角的影響Fig.3 Effect of cross-linking on contact angles

3 結(jié)論

通過乙醇提取法和等電點沉淀法相結(jié)合并輔以超聲處理的方法，得到小麥醇溶蛋白最優(yōu)的提取結(jié)果：添加60%乙醇和5mmol/L檸檬酸緩沖液，并超聲29.67min。以提取獲得的小麥醇溶蛋白粗提物為底物，利用胃蛋白酶進行水解，以水解不同時間的粗提物為底物，進行MTGase點修飾反應，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gly-O-Et與未水解EXTs微粒懸濁體系點修飾反應2 h時，對應產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性顯著提高；EACA與未水解產(chǎn)物點修飾4 h時，對應乳化穩(wěn)定性相對較高；MEA與未水解產(chǎn)物交聯(lián)2 h時的產(chǎn)物其乳化穩(wěn)定性最好。

受水解時間、氨基供體和點修飾時間的影響，點修飾對水解粗提物的乳化穩(wěn)定性影響較為復雜。然而，點修飾對粗提物乳化穩(wěn)定性的影響小于水解時間的影響。同時，受?；w基團的不同，點修飾反應前、后粗提物的熱穩(wěn)定性不同，對粗提物的粒徑和電位造成的影響有限，而基于吸附能和三相接觸角的關系，EACA點修飾產(chǎn)物對應的乳液符合制備Pickering固體微粒的要求。

本研究以小麥醇溶蛋白粗提物及其酶解產(chǎn)物為底物，利用3種不同氨基供體調(diào)控MTGase進行點修飾改性來提高其乳化穩(wěn)定性，并從多角度探究點修飾對EXTs物理化學特性的影響，為擴大小麥醇溶蛋白在食品工業(yè)領域中的應用提供一定的論據(jù)。