血友病鼠關(guān)節(jié)病模型構(gòu)建研究進(jìn)展

孫慶云閆振宇

(1. 華北理工大學(xué)，河北唐山 063000；2. 華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北唐山 063000)

血友病是一種遺傳性X 染色體相關(guān)出血性疾病，主要是由FVIII 或FIX 異常引起。 全球約有40 萬人受累，男性發(fā)病率遠(yuǎn)大于女性，大約每5000 個男性新生兒中有1 例為血友病A 患者，大約每30000 個男性新生兒中有1 例為血友病B 患者[1]。 在臨床上，血友病A和B 難以區(qū)分，診斷必須通過分析特異性因子來確定，根據(jù)Ⅷ因子和Ⅸ因子的水平分為：重型(≤1%)、中型(2% ～5%)、輕型(6% ～40%)[2]。 重型血友病常表現(xiàn)為為關(guān)節(jié)和肌肉自發(fā)性出血，復(fù)發(fā)性出血導(dǎo)致滑膜肥厚、軟骨損傷、關(guān)節(jié)間隙丟失和骨質(zhì)改變，靶關(guān)節(jié)活動的減少導(dǎo)致肌肉持續(xù)性萎縮、關(guān)節(jié)強(qiáng)直、骨質(zhì)疏松，最終導(dǎo)致血友病性關(guān)節(jié)病[3-7]。

血友病性關(guān)節(jié)病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括軟骨代謝紊亂，軟骨細(xì)胞凋亡加速，滑膜細(xì)胞異常增殖以及滑膜液中炎性分子水平增加等，同時，其發(fā)病的危險(xiǎn)因素也較多，例如治療情況，功能鍛煉，肥胖，年齡等[8]。 其患者的四肢任何關(guān)節(jié)都可發(fā)生關(guān)節(jié)積血，其中膝、肘和踝關(guān)節(jié)居多，而髖部、肩部和腕部受累較少見[9]。 從長期來看，治療不當(dāng)?shù)幕颊叱３蜻M(jìn)展性關(guān)節(jié)病而喪失活動能力[10]。 目前血友病性關(guān)節(jié)病的治療包括預(yù)防治療，物理治療，關(guān)節(jié)腔穿刺，關(guān)節(jié)置換術(shù)等[11]。 對于血友病，最主要的治療還是預(yù)防治療，如果不進(jìn)行預(yù)防，大多數(shù)重型血友病患者將在2 ～5 歲之間發(fā)生關(guān)節(jié)內(nèi)出血，并在其二三十歲時發(fā)生血友病性關(guān)節(jié)病[12]。Manco-Johnson 等[13]發(fā)現(xiàn)血友病患者關(guān)節(jié)或軟骨下骨中的慢性微出血會導(dǎo)致沒有臨床證據(jù)的關(guān)節(jié)惡化，而預(yù)防治療可以阻止這一亞臨床過程。 主要的檢測方法是通過放射學(xué)或磁共振成像(MRI)來評估關(guān)節(jié)的損傷程度，當(dāng)顯示軟骨下囊腫、表面糜爛或關(guān)節(jié)間隙變窄即可定義為關(guān)節(jié)損傷，根據(jù)關(guān)節(jié)的出血次數(shù)和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的改變，得知預(yù)防治療和按需治療均有不同程度的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)改變，但預(yù)防治療的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的正常率大于按需治療的患者。 且有研究表明，90%以上接受預(yù)防性治療的患者在30 ～40 歲時出現(xiàn)關(guān)節(jié)病變[14-15]。 隨著進(jìn)行性關(guān)節(jié)病患者的健康相關(guān)生存質(zhì)量(HRQoL)的惡化[16-17]，以及為緩解疼痛和改善關(guān)節(jié)功能而進(jìn)行的骨科干預(yù)治療所需的相關(guān)費(fèi)用的高昂，使血友病性關(guān)節(jié)病的預(yù)防治療成為血友病治療的主要目標(biāo)。

目前，膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型是國際上公認(rèn)的關(guān)節(jié)炎模型[18]。 但由于血友病的自發(fā)性出血，不適于這種構(gòu)建方式。 目前已經(jīng)成功構(gòu)建的血友病動物模型包括血友病犬、綿羊、大鼠、小鼠和豬，但其中血友病犬、綿羊，豬多由自發(fā)性基因突變形成，而血友病鼠通常是通過破壞靶向基因而構(gòu)建相應(yīng)的模型[19]。 在相關(guān)研究中，犬類、綿羊、豬類模型容易受到實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量的限制，而兔類模型容易受到模型構(gòu)建的限制[20]，因而通過使用血友病鼠類模型，創(chuàng)建一個新的血友病性關(guān)節(jié)病動物模型成為研究者的最佳選擇，以便進(jìn)一步研究血友病性關(guān)節(jié)病的發(fā)病機(jī)制以及預(yù)防治療。

1 血友病性關(guān)節(jié)病小鼠模型的建立

2008 年，Hakobyan 等[21]通過使用F8 基因敲除的重型血友病A 小鼠(E16 FVIII B6；129S4-F8tm1kaz/J)[22-23]，由 Dr Haig Kazazian ( University of Pennsylvania，Philadelphia，PA，USA)提供，F(xiàn)9 基因敲除的重型血友病B 小鼠(B6；129P2-F9tm1Dws/J)[24]，由 Darrel Stafford(Department of Biology，University of North Carolina at Chapel Hill)提供，和野生型小鼠(C57BL/6J)，購買自Jackson 實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor，ME，USA)。 三種小鼠菌株成功構(gòu)建血友病性關(guān)節(jié)病小鼠模型。 該研究得到了Institutional Animal Care 和Use Committee of RUSH University 的審查和批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)中所有小鼠都按照委員會的指導(dǎo)方針進(jìn)行了維護(hù)和治療。A、B 型血友病小鼠關(guān)節(jié)病模型的構(gòu)建方法相同。 在實(shí)驗(yàn)中通過用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉3 ～4 月齡的小鼠，剪除雙側(cè)膝關(guān)節(jié)毛發(fā)，使用30 g 針在每只小鼠的右膝關(guān)節(jié)囊髕骨下穿刺一次出血。 部分小鼠在關(guān)節(jié)損傷前接受人重組因子VIII(recombinant human coagulation VIII，rhFVIII)靜脈注射，劑量為280 U/kg(相當(dāng)于100%校正)，每只動物左膝作為未受影響的對照組，檢查被穿刺關(guān)節(jié)是否出血，并在穿刺后24 h 皮下注射止痛劑。動物在受傷后特定時間被處死，并測量小鼠膝關(guān)節(jié)從外側(cè)到內(nèi)測的最大直徑[20]，隨后對小鼠的膝關(guān)節(jié)進(jìn)行組織學(xué)檢查，并進(jìn)行數(shù)字成像、X 線平片和顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描成像，并對結(jié)果進(jìn)行分析。 結(jié)果顯示在單個且大量的關(guān)節(jié)積血后，血友病小鼠在14 d 后發(fā)生關(guān)節(jié)病，顯微CT 也證明關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)損傷與Manco-Johnson 的研究結(jié)果一致[13]。 通過這些研究指標(biāo)初步證明，血友病性關(guān)節(jié)病小鼠模型的成功構(gòu)建。

2 血友病性關(guān)節(jié)病小鼠模型的應(yīng)用研究

血友病性關(guān)節(jié)病小鼠模型的成功構(gòu)建，推動了研究者對于該種疾病的研究進(jìn)展，為此后關(guān)于該疾病的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，提供了必要的動物模型支持條件。 2008 年，Sun 等[25]使用該模型，向小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)或靜脈注射人凝血因子IX(human coagulation IX，hFIX)，發(fā)現(xiàn)接受關(guān)節(jié)內(nèi)注射的小鼠免于滑膜炎的侵害。 隨后在此基礎(chǔ)上，他們將表達(dá)hFIX 的腺相關(guān)病毒(AAV)基因轉(zhuǎn)移載體注射到血友病B 小鼠的膝關(guān)節(jié)，結(jié)果顯示用載體治療的關(guān)節(jié)在損傷后2 周出現(xiàn)的病理改變明顯減少，證明在沒有循環(huán)FIX 的情況下，血管外因子活性和關(guān)節(jié)導(dǎo)向基因轉(zhuǎn)移可改善血友病性關(guān)節(jié)病。 2013 年，Coeleveld 等[26]在細(xì)胞因子的聯(lián)合應(yīng)用在早期軟骨損傷過程中是否有效的實(shí)驗(yàn)研究中，通過針刺誘導(dǎo)血友病小鼠關(guān)節(jié)出血，將IL-4 和IL-10 的混合溶劑和對照溶劑分別注射到關(guān)節(jié)腔內(nèi)，通過觀察35 d 后關(guān)節(jié)的損傷程度，同時檢測關(guān)節(jié)退化所需的時間，證明關(guān)節(jié)出血后單次關(guān)節(jié)內(nèi)注射IL-4 和IL-10 的混合試劑可限制血液誘導(dǎo)的軟骨退變，而且提高兩種因子的生物利用度會提高其在軟骨退變中的保護(hù)作用。 由于許多編碼細(xì)胞因子、生長因子和缺氧調(diào)節(jié)因子的基因均可被NFκB 激活，且其中許多基因是關(guān)節(jié)疾病發(fā)病機(jī)制的一部分，因此推斷NF-κB 相關(guān)通路可能在血液誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)損傷中起關(guān)鍵作用。 為進(jìn)一步了解其作用機(jī)制，Sen等[27]在2013 年使用血友病性關(guān)節(jié)病小鼠模型，監(jiān)測傷后一定時間內(nèi)NF-κB 相關(guān)因子的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào)，由此表明NF-κB 相關(guān)的信號通路參與血友病性關(guān)節(jié)病的發(fā)生。 隨后在2016 年，Hakobyan 等[28]再次使用血友病小鼠關(guān)節(jié)積血模型，對可見出血評估(VBA)，關(guān)節(jié)直徑(JD)，關(guān)節(jié)外出血評分(EBS)和關(guān)節(jié)內(nèi)出血評分(IBS)4 項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了評估，將EBS 和IBS兩項(xiàng)指標(biāo)總結(jié)為關(guān)節(jié)出血評價(jià)系統(tǒng)(BSS)，為臨床前止血藥物的開發(fā)提供了一個新的、有價(jià)值的補(bǔ)充。 2018年，Haxaire 等[29]發(fā)現(xiàn)針刺誘導(dǎo)關(guān)節(jié)出血導(dǎo)致FVIII 缺陷小鼠損傷關(guān)節(jié)中TNF-α 水平升高，且TNF-α 或iRhom2 失活可減少血友病性關(guān)節(jié)病小鼠模型中出現(xiàn)的骨質(zhì)減少和滑膜炎癥，由此可知血液進(jìn)入關(guān)節(jié)激活了iRhom2/ADAM17/TNF-α 途徑，從而導(dǎo)致小鼠骨質(zhì)減少和滑膜炎，因此，該促炎信號通路成為預(yù)防血友病關(guān)節(jié)病患者骨質(zhì)疏松和關(guān)節(jié)損傷的新靶點(diǎn)。

上述多項(xiàng)研究中應(yīng)用了血友病性關(guān)節(jié)病小鼠模型，說明其模型適用于該疾病實(shí)驗(yàn)研究，具有可用性。其體型大小使其易于運(yùn)輸。 但是不可否認(rèn)，其仍具有尚未完善的部分。 小鼠模型的主要缺點(diǎn)是缺乏自發(fā)性出血表型，并且只能分析小體積的血液樣本，這限制了該模型的適用性，從而無法深入了解再出血的機(jī)制[30]。雖然血友病犬表現(xiàn)自發(fā)性出血表型，且與人類有明顯的F8 基因同源性，每年出血發(fā)作1 ～5 次，但是其繁殖率較低并且支持研究所需的設(shè)施昂貴，并且很難在研究中接觸到大量動物。 血友病綿羊與血友病豬具有體型和自發(fā)性出血表型的優(yōu)勢，但管理起來相當(dāng)費(fèi)力[19，31-32]。 因此，就要求其他合適的關(guān)節(jié)病動物模型的構(gòu)建，使其更適于其他深入研究。 有研究表明[30]，血友病大鼠與人類血友病患者具有相似的表型，表現(xiàn)為血液循環(huán)受損和自發(fā)性肌肉骨骼出血，與血友病小鼠相比，血友病大鼠的身體和血容量約為小鼠的10 倍，且允許更大和更頻繁的血液采樣。 根據(jù)指導(dǎo)方針[33]，25 g 的小鼠一周內(nèi)只能采集135 IL 的血液樣本，而250 g 的大鼠一周可以采集1200 IL 的血液樣本，這有助于在縱向疾病進(jìn)展研究中大鼠作為自身基線對照，從而改進(jìn)研究設(shè)計(jì)，并減少所需要的動物數(shù)量。 此外，大鼠具有與小鼠相同的繁殖和住房優(yōu)勢，且大鼠體型較大也可進(jìn)行臨床相關(guān)成像。 由此可知，血友病性關(guān)節(jié)病大鼠模型將更受到研究者的青睞。

3 血友病性關(guān)節(jié)病大鼠模型的構(gòu)建

2016 年，S?rensen 等[34]人通過使用13～15 周齡的F8-/-大鼠(SD-F8tm1sage)在Sprague Dawley 背景下，飼養(yǎng)于Novo Nordisk A/S(Maaloev，Denmark)，和野生型大鼠成功構(gòu)建血友病關(guān)節(jié)病大鼠模型。 該研究得到了Danish Ministry of Justice 的批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)中所有動物都根據(jù)Danish Animal Experiments Council 的指導(dǎo)方針進(jìn)行。 大鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下，光照/黑暗周期為12 h/12 h，溫度為20 ～23 ℃，相對濕度為30% ～60%，自由進(jìn)食和飲水，每天監(jiān)測出血體征。 F8-/-大鼠的數(shù)據(jù)曾報(bào)道過，證實(shí)F8-/-大鼠是血友病A 的轉(zhuǎn)化動物模型[30]。 在實(shí)驗(yàn)中用5%異氟烷、0.7 L/min O2、0.3 L/min N2O 誘導(dǎo)，2%異氟烷、0.7 L/min O2、0.3 L/min N2O 維持麻醉，在吸入麻醉下進(jìn)行所有入侵手術(shù)。 將20 只野生型大鼠和60 只F8-/-大鼠，隨機(jī)分配到兩個損傷類型，一組(10 只野生型大鼠和40 只F8-/-大鼠)在第0 天接受單次針刺誘導(dǎo)出血，在第14 天處死。 另一組(10 只野生型大鼠和20 只F8-/-大鼠)在第0 天和第14 天分別接受針刺誘導(dǎo)出血，在第28 天處死，目的是研究再次出血是否會加重血友病性關(guān)節(jié)病的進(jìn)展。在接受針刺誘導(dǎo)出血前，F(xiàn)8-/-大鼠按1 ∶1隨機(jī)分配，接受300 IU/kg rhFVIII 或者相同體積的緩沖液治療。rhFVIII 的劑量是基于F8-/-大鼠血漿中APTT 的體外正?；痆30]，野生型大鼠給予緩沖液。 然后對大鼠進(jìn)行麻醉，靜脈注射rhFVIII 或緩沖液后，皮下注射丁丙諾啡0.03 mg/kg 鎮(zhèn)痛，有研究表明丁丙諾啡作為鎮(zhèn)痛劑不會影響膝關(guān)節(jié)出血后的炎癥影響[35]。 剪掉左膝上的毛發(fā)，用30 g 針穿過髕骨韌帶，引發(fā)關(guān)節(jié)出血。 在接下來7 d，在飲用水中添加6 mg/L 的丁丙諾啡。

根據(jù)慢性關(guān)節(jié)病變評分系統(tǒng)[36]，組織學(xué)評估及日常評估得出，所有未經(jīng)治療的血友病關(guān)節(jié)病動物切片的組織病理學(xué)評估符合血友病[37-40]。 預(yù)防性使用rhFVIII 治療顯著降低了關(guān)節(jié)的病理，并顯示關(guān)節(jié)出血臨床癥狀的減少，從而證實(shí)了F8-/-大鼠作為血友病關(guān)節(jié)病相關(guān)模型的潛力。 初步證明血友病性關(guān)節(jié)病大鼠模型構(gòu)建成功。

4 血友病性關(guān)節(jié)病大鼠模型的應(yīng)用研究

眾所周知，凝血因子VIII 替代治療血友病A 最嚴(yán)重并發(fā)癥是產(chǎn)生中和抗體，為進(jìn)一步研究出血是否會促進(jìn)抑制物的形成，2016 年，L?vgren 等[41]將血友病大鼠分為兩組，其中一組接受針刺出血，另一組作為對照，隨后均給予rhFVIII 治療，通過分析結(jié)果證明關(guān)節(jié)出血后給予rhFVIII 治療可加強(qiáng)抑制物的形成，這表明出血是潛在的危險(xiǎn)信號，即rhFVIII 替代療法同時并發(fā)出血可增加抑制物的形成。 隨后Christensen 等[42]在2017 年使用體內(nèi)US(Ultrasonography，US)和體外μCT檢測血友病性關(guān)節(jié)病大鼠的膝關(guān)節(jié)，觀察到與血友病性關(guān)節(jié)病相關(guān)的病理，并且μCT 確定的疾病嚴(yán)重程度與組織病理學(xué)之間存在強(qiáng)相關(guān)性，rhFVIII 治療可降低兩種成像技術(shù)確定的病理，證明US 和μCT 是檢測血友病性關(guān)節(jié)病的合適成像技術(shù)，可用于疾病進(jìn)展的縱向研究。 研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)產(chǎn)生抑制物的血友病患者不能誘導(dǎo)免疫耐受，需要旁路制劑進(jìn)行長期出血管理。重組人活化凝血因子VII (recombinant human coagulation VII，rhFVIIa)是血友病抑制物患者出血的按需旁路止血劑。 預(yù)防性使用rhFVIIa 可以使產(chǎn)生抑制物的患者得到持續(xù)的止血治療，但在這種情況下，rhFVIIa 循環(huán)水平和臨床結(jié)果的關(guān)系仍不清楚。 為了解決這一問題，Zintner 等[43]在2019 年使用該大鼠模型，通過腺相關(guān)病毒(AAV)基因轉(zhuǎn)移模擬了大鼠FVIIa轉(zhuǎn)基因的活化因子VII 預(yù)防，與未經(jīng)處理的血友病性關(guān)節(jié)病大鼠相比，重組大鼠FVIIa 按需給藥可緩解出血。當(dāng)大鼠FVIIa 轉(zhuǎn)基因水平≥708 ng/mL 可減少血友病大鼠的出血，而水平＞1250 ng/mL 則可消除出血。 這些數(shù)據(jù)首次確定了在模擬FVIIa 預(yù)防的環(huán)境中，血友病性關(guān)節(jié)病動物的FVIIa 循環(huán)抗原水平和出血比例之間的關(guān)系。

上述各項(xiàng)研究表明，血友病性關(guān)節(jié)病大鼠模型的成功構(gòu)建為以后的一系列深入研究提供了必要前提。 首先，血友病性關(guān)節(jié)病大鼠模型可表現(xiàn)出與人類類似的自發(fā)性出血表型，其次，大鼠的繁殖優(yōu)勢可使我們快速獲得具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的大隊(duì)列數(shù)據(jù)，以識別治療引起的臨床變化。 相關(guān)優(yōu)勢使得該模型有助于對血友病性關(guān)節(jié)病的發(fā)病機(jī)制及治療干預(yù)的研究。 但是，由于是自發(fā)性出血模型，非預(yù)期出血可能給實(shí)驗(yàn)帶來偏倚，且出血量大小未知，這是在以后的實(shí)驗(yàn)中需要克服的一大難題。

5 總結(jié)及展望

目前血友病性關(guān)節(jié)病是血友病最嚴(yán)重的并發(fā)癥，其并病理生理機(jī)制尚不完全清楚，因此構(gòu)建相應(yīng)的動物模型，進(jìn)一步研究其機(jī)制，成為了研究者最關(guān)注的問題。 實(shí)驗(yàn)鼠因其自身優(yōu)勢，如繁殖量大，便于管理等成為實(shí)驗(yàn)中最常用的實(shí)驗(yàn)動物。血友病小鼠關(guān)節(jié)病模型已成功構(gòu)建，但小鼠采血量小且缺乏自發(fā)性出血表型，進(jìn)而選擇體積相對較大的SD 大鼠，但因其自發(fā)性出血，出血量大小未知，也為實(shí)驗(yàn)帶來了一定的困難。 雖然各種動物模型均有利弊，但是實(shí)驗(yàn)動物模型為實(shí)驗(yàn)研究帶來的優(yōu)勢不容小覷。 總之，建立一種生理指標(biāo)穩(wěn)定、模型構(gòu)建簡單、且易操作的血友病性關(guān)節(jié)病模型有助于我們對血友病性關(guān)節(jié)病的發(fā)病機(jī)制、病理改變的進(jìn)一步認(rèn)知，也為新型療法的開發(fā)比如基因治療提供了可能，并且為今后的臨床研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。