?；铙w采卵技術研究進展

姚順，趙明禮，張明，杜衛(wèi)華，戴蘊平，朱化彬

（1.廣西大學亞熱帶農業(yè)資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004；2.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；3.天津中科博雅生物育種研究有限公司，天津 300000；4.中國農業(yè)大學生物學院，北京 100193）

雖然胚胎移植技術在奶牛和肉牛生產(chǎn)中得到了廣泛應用，但是超數(shù)排卵生產(chǎn)體內胚胎的效率近70年來幾乎沒有提高[1]。近年來，隨著體外受精（Fertilization in vitro，IVF）技術的不斷完善，體外受精胚胎成為牛胚胎移植的重要胚胎來源，特別是活體采卵（Ovum pick up, OPU）生產(chǎn)的體外受精胚胎。OPU技術可借助超聲波儀器，通過穿刺從母?；铙w卵巢上可見卵泡中采集卵母細胞用于牛體外胚胎生產(chǎn)（In vitro production，IVP），從而生產(chǎn)大量遺傳背景清晰的體外受精胚胎，因此，牛活體采卵體外生產(chǎn)胚胎（OPU/IVP）技術經(jīng)過不斷改進和完善，極大地提高了良種母牛卵子的利用率和繁殖效率，成為快速擴繁優(yōu)秀母牛的技術，在全世界，尤其是美洲國家得到廣泛應用[2]。

本文主要綜述牛OPU技術優(yōu)勢，重點分析影響OUP效率的因素，以期為牛OUP胚胎生產(chǎn)提供參考。

1 OPU 的技術特點和優(yōu)勢

OPU作為一項重要的繁殖技術，具有胚胎生產(chǎn)效率高、獲得卵母細胞種源明確、可大幅提高良種母牛的利用效率和可控制胚胎性別等優(yōu)勢，相較于傳統(tǒng)育種具有更高的選擇強度和更短的世代間隔。該技術的應用推動了良種牛的基因修飾和早期胚胎的育種值評估。

1.1 胚胎生產(chǎn)效率高

采用人工授精，一頭優(yōu)質母牛每年僅能生產(chǎn)一頭牛犢。利用超數(shù)排卵結合胚胎移植技術，與正常發(fā)情期相比可獲得更多的胚胎，但生產(chǎn)胚胎數(shù)量仍十分有限，一頭牛每年最多能生產(chǎn)20枚左右胚胎，年均產(chǎn)犢數(shù)（以受孕率50%計算），一頭優(yōu)質母牛每年最多只能生產(chǎn)10頭牛犢，且每次只能與一頭公牛進行受精，并需要外源激素處理，對母牛后續(xù)的生殖功能可能造成影響?；铙w采卵技術每頭供體牛每次可獲得10～50枚卵母細胞，每年最多可生產(chǎn)50頭小牛，數(shù)量多且穩(wěn)定，可大大提高繁殖效率，是現(xiàn)有繁殖技術中效率最高的[3]。

1.2 卵母細胞遺傳背景清晰

進行活體采卵的供體母牛往往擁有詳細的系譜資料，因此，利用活體采卵技術獲得的卵母細胞系譜齊全、遺傳背景清晰?？稍诰C合考慮生產(chǎn)性能、體型外貌和遺傳缺陷檢測的基礎上對受精的精液進行選擇，提高選配的科學性。

1.3 可充分利用優(yōu)秀的母牛及推動品種保護

OPU/IVP可用于3月齡以上的犢牛及孕早期（懷孕3個月以內）、圍產(chǎn)期、超數(shù)排卵效果不明顯和輸卵管堵塞的母牛[3]，從而可充分利用優(yōu)秀的母牛，極大地提高良種母畜的利用效率，對品種保護和改良均具有積極意義。例如，印度由于宗教原因不允許宰殺牛，通過對印度地方品種Karan Fries牛進行OPU收集卵母細胞，進行胚胎移植，有力地保護了地方優(yōu)良品種[4]。

2 影響OPU 效率的因素

目前，OPU技術已成為體外生產(chǎn)優(yōu)質牛胚胎的有效途徑，但其效率受諸多因素影響，供體牛年齡、OPU頻率、外源激素處理、優(yōu)勢卵泡的去除與否和動物發(fā)情周期等均會影響OPU的效率[5]。

2.1 供體牛年齡的影響

母牛性成熟一般在8～12月齡，適宜的初配年齡在16～27月齡，對幼畜進行OPU能縮短世代間隔一年以上。但由于幼畜進行OPU時，尚未獲得表觀信息，選擇的準確性不高，可以抵消了這一優(yōu)勢，且對幼牛進行OPU需采取侵入性更強的手術法，涉及動物福利問題，此外與成年牛來源的卵母細胞相比，幼牛的卵母細胞發(fā)育率明顯較低，所以目前不常對幼牛進行OPU[3]。

2.2 采卵頻率的影響

OPU頻率通常為一周一次、一周兩次或兩周一次。其中，一周一次與兩周一次的效果類似；一周兩次的OPU效果更優(yōu)。一周兩次的時間間隔為2～3d[6]，3d后牛卵巢可再次形成優(yōu)勢卵泡；此時如不及時采卵，改為間隔7d的每周一次采取，由于優(yōu)勢卵泡主控了促卵泡素（follicle-stimulating hormone, FSH）的合成分泌，可導致劣勢卵泡的衰退和閉鎖，從而使卵母細胞數(shù)量減少；每周采卵兩次能有效避免優(yōu)勢卵泡對從屬卵泡的影響。無外源激素處理下，一周進行兩次OPU的供體牛，無性周期、無黃體、無高水平雌激素[3]，而高水平雌二醇會對卵母細胞成熟和發(fā)育能力產(chǎn)生不利影響[6]。每周三次OPU，不符合動物福利、成本高，且頻繁的穿刺會對卵巢造成損傷，影響牛的內分泌[3]。

2.3 激素處理的影響

為了提高OPU的效果，采卵前常使用FSH或孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotrophin, PMSG）處理供體母牛。1978年，Brown提出了FSH閾值理論，認為FSH濃度在卵泡發(fā)育早期相當重要，一旦FSH達閾值，卵泡即迅速進入生長階段；FSH超過閾值的程度及其持續(xù)時間最終決定成熟卵泡的數(shù)目[7]。研究人員采用切除垂體、切斷下丘腦和用GnRH拮抗劑處理等方法抑制或阻斷促性腺激素的分泌，造成全部有腔卵泡停止生長，證明了FSH可促進卵母細胞發(fā)育[8]。此外，人為提高FSH濃度可使更多的卵泡參與周期性募集[9]。幼牛的OPU需要與外源激素配合以提高獲得的卵母細胞質量[10]。多數(shù)研究表明，外源激素對成年牛和妊娠母牛的OPU效果有顯著的促進作用[11]，可提高供體奶牛卵裂率和囊胚率，原因是FSH利于卵泡發(fā)育同期化，使卵泡發(fā)育整齊，有利于卵母細胞發(fā)育和在采卵前卵母細胞在體內的成熟[12]。但有一部分研究顯示，外源激素預處理對OPU效果無顯著影響，原因可能是隨著激素的持續(xù)使用，卵巢上激素受體的敏感性下降所致[13]。

FSH預處理效果優(yōu)于PMSG預處理[13]，當FSH和PMSC分別處理營養(yǎng)不良且長期不發(fā)情的荷斯坦牛時，F(xiàn)SH預處理組的可穿刺卵泡數(shù)和獲得卵母細胞數(shù)均多于PMSC預處理組[14]。但陳明棠等在富鐘水牛研究PMSG和FSH預處理對OPU效果的影響時，發(fā)現(xiàn)PMSG組與FSH組的可用率、平均每頭可用卵母細胞數(shù)無顯著差異[15]，這可能是由于品種間的差異造成的。當每周采卵兩次時，激素預處理對OPU的效果無顯著影響，可能是每周兩次的采卵使內源性FSH濃度升高，從而掩蓋了外源FSH的作用[16]。用30%的聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone, PVP）溶解FSH可延長FSH在牛體內的半衰期，顯著提高活體采卵的效果[17]。因此，需根據(jù)供體牛的年齡和狀態(tài)，選擇合適的激素種類和注射劑量[5]，同時兼顧生產(chǎn)成本和收益。

2.4 優(yōu)勢卵泡的影響

牛的每個發(fā)情周期有2～3批原始卵泡發(fā)育為三級卵泡，即有2～3個卵泡波。有研究表明，1組直徑約為3mm的有腔卵泡，在FSH作用下生長形成1個卵泡波，2～3d后形成1個優(yōu)勢卵泡，直徑達8～10mm，開始抑制從屬卵泡的生長發(fā)育。其抑制途徑有兩個，一是優(yōu)勢卵泡可分泌抑制素（主要是抑制素B），反饋抑制垂體前葉分泌FSH；二是發(fā)育中的優(yōu)勢卵泡快速生長，隨著卵泡的生長和顆粒細胞的增多，血清中雌激素水平升高，從而降低FSH濃度[9]。而優(yōu)勢卵泡因具有大量的FSH受體，可補償?shù)虵SH水平，并繼續(xù)發(fā)育。

鑒于優(yōu)勢卵泡對從屬卵泡的抑制作用，去除優(yōu)勢卵泡（DFR）與否成為影響OPU效率的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，去除優(yōu)勢卵泡后1.5d，內源性FSH濃度激增，2d后發(fā)生新的卵泡波[18]。去優(yōu)勢卵泡前原有的和之后新產(chǎn)生的卵泡波中的中、小卵泡是卵母細胞的主要來源。卵母細胞在卵泡中生長時間越長，其中儲存mRNA和蛋白質越多，其擁有更強的胚胎發(fā)育能力[19]。

在DFR-OPU 1/W、DFR-FSH-OPU 1/W和FSHOPU 2/W組合中，效果最好的是DFR-FSH-OPU 1/w組合。在DFR-FSH-OPU 1/w中，內源性FSH升高與注射的FSH相疊加，使FSH峰升高且延長了持續(xù)時間，從而產(chǎn)生了更強的卵泡波反應， FSH注射與進行OPU之間的48h滑行階段（FSH饑餓階段）為卵母細胞發(fā)育的最佳時機[20]，加上之前DFR的促進作用，使該組合產(chǎn)生的囊胚總量最多。超數(shù)排卵中，長期外源激素刺激會使卵泡處于加速生長階段，使卵泡中的卵母細胞未獲得充分的發(fā)育能力[20]。48h的FSH饑餓使卵泡生長停滯，讓卵母細胞質“趕上”卵泡成熟和呈現(xiàn)早期閉鎖樣狀態(tài)[21]。對牛而言，早期閉鎖似乎與體內的排卵前成熟狀態(tài)類似，因此，增強了卵母細胞發(fā)育能力[22]。

2.5 供體牛發(fā)情周期的影響

一般處于乏情期的母牛卵泡數(shù)較少，卵巢質地偏硬，不適于進行活體采卵[23]。發(fā)情期的不同階段活體采卵效果也有明顯差異。Pieterse等研究顯示發(fā)情周期的第3～4天可吸取卵泡數(shù)多于第9～10天和第15～16天[24]。朱化彬等研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)情當天獲得的卵母細胞數(shù)和可用卵母細胞數(shù)均少于發(fā)情第7天和第7～15天，這是因為發(fā)情當天吸取了卵巢上大卵泡形成的凹陷及卵泡膜阻礙了周圍其他小卵泡的采集[25]。

2.6 其他因素

除了以上因素，OPU效率還會受到個體差異[26,27]、健康狀況[8]、季節(jié)[23]、品種[28]、真空泵壓力[5]等多方面的影響。

Pontes等對317頭內洛爾牛（Nelore）進行跟蹤研究，發(fā)現(xiàn)不同個體的OPU效果存在明顯差異，但同一供體在不同時期的OPU效果相似[26]。卵母細胞質量好（即體外受精后囊胚質量高）的供體卵母細胞內的谷胱甘肽(glutathione GSH)濃度顯著高于質量差的卵母細胞的濃度，氧化應激標志物谷胱甘肽過氧化物酶在較差供體來源的卵丘-卵母細胞復合物（COCs）中的含量顯著高于較好供體來源的COCs，谷胱甘肽合成酶在較好供體來源的COCs中的含量顯著高于來自較差供體來源的COCs，可見提高卵母細胞中谷胱甘肽濃度可以減少供體間胚胎生產(chǎn)的差異[19]。

前人研究表明，牛的卵泡形成、卵母細胞質量和受精率受環(huán)境溫度影響，而環(huán)境溫度可能影響類固醇激素水平，并延遲卵母細胞的細胞膜內黃體溶解和脂肪酸組成。Zou等發(fā)現(xiàn)夏季每個卵巢少于10個卵泡的卵巢的百分比明顯高于冬季，此外，卵泡液、顆粒細胞和卵母細胞中脂肪酸組成在兩個季節(jié)有明顯的差別[29]。Wilson認為母牛在熱應激情況下，由于黃體溶解延遲和雌二醇水平降低，卵泡的形成會受到延遲[30]，因此夏季的OPU效果明顯降低。

Nelore牛的卵泡數(shù)多于B.taurus牛[28]。目前，Nelore母牛比B.Taurus母牛產(chǎn)生更多卵泡的原因仍未清楚。在雌性Nelore和B.Taurus的胎?；蛘咝∨Ｖ懈]前（原始、初級和次級）卵泡數(shù)量并沒有顯著差異，表明總卵泡數(shù)量不是卵母細胞產(chǎn)量差異的原因[28]?？赡苁窃贜elore牛中的卵泡閉鎖速率較低。另一個值得考慮的原因是卵泡的更新，該問題有待進一步的研究[31]。

3 OPU/IVP 所得后代性別比例

2016年通過OPU共收集約200萬枚卵母細胞，獲得可移植胚胎65.6萬枚，其中約30萬枚胚胎是由性控精液受精產(chǎn)生[2]。

1991年研究報道了第一例IVF牛的性別偏差[32]。不同的研究中OPU/IVP產(chǎn)生的后代性別比例結果不盡相同，OPU/IVP是否對后代性別比例造成影響目前無統(tǒng)一的定論。Machado等表明用Pecoll離心處理后的精子通過IVP后獲得胚胎雌性和雄性比例無顯著差異[27]。巴西In vitro Brasil有限公司在大量OPU/IVP重復實驗中統(tǒng)計的雌雄性別比例也均為1：1[5]。然而，有研究表明一種巴西Gyr奶牛通過OPU采卵后進行IVP與人工授精和自然交配相比，獲得的后代雄性比例高達76.9%，顯著高于雌性[33]。造成OPU/IVP生產(chǎn)中性別比例偏離自然狀態(tài)的部分原因是精子制備液和培養(yǎng)液[33]。配子發(fā)生和早期胚胎發(fā)育過程中基因組有兩次甲基化和去甲基化，大多數(shù)母源印記發(fā)生在第二次減數(shù)分裂中期，父源印記基因在IVF前已完成重編程。卵母細胞體外培養(yǎng)，超數(shù)排卵和IVF可能干擾卵子的甲基化。該過程中輔助生殖可能引起表觀遺傳變異，體外培養(yǎng)可以干擾X染色體失活的表觀遺傳過程[34]。X染色體失活是雌性胚胎在早期發(fā)育中經(jīng)歷的表觀修飾事件，如果這一機制被削弱，會導致雌性胚胎發(fā)育異常，進而導致性別失衡，而通過改變體外受精培養(yǎng)方法，可以矯正性別比例偏差[35]。

4 結束語

OPU是獲取高價值的、珍稀品種的牛卵子的重要手段，其通過結合最優(yōu)秀的公牛和母牛加速遺傳增益，在推動良種牛繁育、優(yōu)化牛群結構、保護優(yōu)良種質資源和推動畜牧業(yè)發(fā)展中扮演著重要角色。研究者不斷優(yōu)化OPU方案，以期獲得更多更優(yōu)質的卵子，降低優(yōu)質胚胎的生產(chǎn)成本。今后，仍需進一步推廣OPU結合精子性控技術選擇胚胎性別及OPU與胚胎冷凍保存的共同應用，以降低活體動物運輸?shù)某杀竞徒獬铙w動物運輸?shù)南拗?，以最大限度地利用高遺傳價值的供體牛。