動(dòng)物雙歧桿菌A6 體內(nèi)外安全性評(píng)價(jià)

周曉娟，桑躍，劉治麟，葛紹陽

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.河北省畜產(chǎn)食品技術(shù)創(chuàng)新中心，廊坊 065201；3.北京和益源生物技術(shù)有限公司，北京 100089）

益生菌是一類對(duì)宿主有益的活性微生物，是定植于人體腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的活性有益微生物的總稱[1]。近年來，隨著研究的深入，人們對(duì)益生菌在人類健康及疾病中的作用有了更加全面及深入的認(rèn)識(shí)，多種益生功能和作用機(jī)制得到了深入的研究，包括改善腸道炎癥[2]、免疫調(diào)節(jié)[3,4]、預(yù)防過敏性疾病[5]等。

益生菌主要應(yīng)用于益生菌制劑、益生菌飲品和膳食添加劑等產(chǎn)品中, 如乳制品、飲料和益生菌膠囊等。調(diào)查表明, 益生菌在我國食品中得到廣泛應(yīng)用，其中80%應(yīng)用于發(fā)酵乳制品[1]。隨著益生菌產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展，與其相關(guān)的功能和安全性研究也得到了越來越多的重視。人們提出一些能夠反映腸道細(xì)菌活性的指標(biāo)，來評(píng)價(jià)乳酸菌的安全性，對(duì)產(chǎn)生的生物胺、耐藥性及毒性因子等潛在安全性風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行研究，成為評(píng)價(jià)益生菌安全性的重要部分[6]。

本試驗(yàn)對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌A6進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，其中體外安全性主要通過研究抗生素抗性、分析有毒代謝物等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)[6]；體內(nèi)安全性主要從菌株的毒理學(xué)、移位可能性等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)[7]。

1 材料和方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

動(dòng)物雙歧桿菌A6，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)功能乳品實(shí)驗(yàn)室提供，中國普通微生物保藏管理中心保藏，菌株號(hào)CGMCC No.9273。培養(yǎng)基組成同文獻(xiàn)[8]。

1.2 試驗(yàn)方法

抗生素敏感性檢測(cè)、生物胺檢測(cè)、動(dòng)物試驗(yàn)設(shè)計(jì)、血生化和血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)、細(xì)菌移位能力評(píng)價(jià)方法均與文獻(xiàn)[8]相同。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 抗生素敏感性

氨基糖苷類、喹諾酮類抗生素及氨多作用于革蘭氏陰性菌，對(duì)革蘭氏陽性菌效果普遍較差。試驗(yàn)結(jié)果表明，A6對(duì)氨基糖苷類、喹諾酮類、糖肽類部分抗生素及胺/氨的敏感性為R或者I（表1），與文獻(xiàn)報(bào)道相符。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌以及植物乳桿菌等乳酸菌天然對(duì)糖肽類抗生素如萬古霉素具有普遍耐受性。從檢測(cè)范圍分析，菌株A6不存在種屬保守耐性以外的抗生素耐受性。菌株的這種固有耐性多為菌株縱向遺傳獲得，而非基因橫向轉(zhuǎn)移，耐性的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)小。

表1 試驗(yàn)菌株藥物敏感性能

2.2 生物胺檢測(cè)

脫羧酶培養(yǎng)基中的溴甲酚紫的有效指示范圍為pH 5.2～6.8，pH值在5.5時(shí)呈黃色，稍大于5.5就會(huì)出現(xiàn)顏色變化，呈現(xiàn)紫色或紫紅色。A6在改良脫羧酶液體培養(yǎng)基培養(yǎng)4d，相對(duì)于空白對(duì)照培養(yǎng)基，添加了鳥氨酸、組氨酸、酪氨酸、精氨酸四種不同氨基酸的液體培養(yǎng)基均呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，表明乳酸菌在其中可以正常生長(zhǎng)，而各培養(yǎng)基均呈黃色，表明菌株生長(zhǎng)并未使培養(yǎng)液pH值升高，初步判斷菌株未產(chǎn)生胺類物質(zhì)。

2.3 口服A6 急性毒性試驗(yàn)

血常規(guī)指標(biāo)可反映試驗(yàn)菌株在血液中的副作用，血生化指標(biāo)反映營養(yǎng)不足及代謝失衡的狀況。這些指標(biāo)的變化通常早于其他的臨床癥狀。本試驗(yàn)中試驗(yàn)組和對(duì)照組血常規(guī)和血生化指標(biāo)未發(fā)生任何顯著變化（表2），說明試驗(yàn)菌株對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物無不利影響。

表2 試驗(yàn)小鼠的血常規(guī)和血生化指標(biāo)（n=10）

2.4 細(xì)菌移位檢測(cè)

細(xì)菌移位是益生菌安全性的最嚴(yán)重問題之一。益生菌移位可引發(fā)感染，包括菌血癥、敗血癥或心內(nèi)膜炎[9,10]。因此，評(píng)價(jià)益生菌的移位能力是十分重要的。本試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組和試驗(yàn)組的組織和血液樣本經(jīng)過培養(yǎng)后，各培養(yǎng)基上均無菌落生長(zhǎng)（表3），表明試驗(yàn)動(dòng)物的組織和血液未受到污染，菌株沒有從腸道轉(zhuǎn)移到組織和血液中，未發(fā)生移位現(xiàn)象。

表3 試驗(yàn)小鼠被試菌轉(zhuǎn)移到肝、脾、腎和血液的移位率

3 結(jié)論

動(dòng)物雙歧桿菌A6不存在種屬特有耐性以外的抗生素耐受性，不存在抗生素轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)；產(chǎn)胺試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)生物胺的產(chǎn)生。以2×108cfu/mL、2×109cfu/mL、2×1010cfu/mL三種菌劑量灌胃小鼠28d，均未發(fā)生不良反應(yīng)，未發(fā)生血液、肝臟、脾臟和腎臟的移位；表現(xiàn)為較高的移位安全性。動(dòng)物雙歧桿菌A6安全性評(píng)價(jià)未發(fā)現(xiàn)菌株的不安全因素。