骨髓潛伏態(tài)巨細胞病毒痕量反復(fù)激活誘導(dǎo)免疫衰老的單細胞RNA 測序技術(shù)研究進展

劉普恒,韓 輝,王宇虹

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 老年醫(yī)學(xué)科,哈爾濱 100081)

免疫衰老是老年人高發(fā)病率和高死亡率的核心機制之一。 廣泛潛伏在老年人群骨髓干細胞的人巨細胞病毒CMV,通過一個分化依賴的反復(fù)痕量激活機制,長期誘導(dǎo)并累積T 細胞的免疫衰老[1]。由于CMV 的痕量激活起始于骨髓干細胞,且病毒潛伏的骨髓干細胞比例很低,潛伏態(tài)CMV 的激活表達量也很低[2-3],而且這些骨髓干細胞表面不產(chǎn)生任何CMV 相關(guān)抗原標記物,這個痕量激活通過偶聯(lián)CD34+全能干細胞的分化[4-5],通過細胞內(nèi)的傳遞幾近 “無痕” 的到達樹突狀細胞(dendric cell,DC)。 樹突細胞中痕量激活的CMV,通過一個細胞-細胞間接觸的方式進行抗原提呈,“沉默” 地誘導(dǎo)T 細胞發(fā)生CMV 特異性的免疫應(yīng)答[6]。 雖然這種應(yīng)答不能有效地清除CMV 潛伏庫,但是骨髓內(nèi)的CMV 在普通人群中(無免疫缺陷) 啟動大量激活而產(chǎn)生急性CMV 病。 通過潛伏態(tài)病毒和宿主的痕量反復(fù)互作,純真(na?ve)T 細胞的多樣性逐漸耗竭,“無效” 記憶效應(yīng)T 細胞克隆擴增大量累積,伴隨每次痕量＄應(yīng)答產(chǎn)生的低水平炎性因子,構(gòu)成了一個漫長的免疫衰老的核心進程[6-8]。 由于該過程隱蔽,痕量,反復(fù),病毒-宿主互作,CMV 誘導(dǎo)免疫衰老的分子調(diào)控機制,一直是全球公認的難題。 伴隨單細胞RNA 測序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq) 技術(shù)的發(fā)展, 免疫衰老的CMV 誘導(dǎo)調(diào)控機制正逐漸被揭示。

1 骨髓潛伏態(tài)巨細胞病毒反復(fù)痕量的激活誘導(dǎo)外周血T 細胞免疫衰老的概述

全世界絕大部分人會在不知不覺中攜帶感染人巨細胞病毒,老年人群的攜帶率接近100%。 人巨細胞病毒(HCMV) 是一個擁有巨大DNA 基因組的皰疹病毒,它初次感染后,即在骨髓干細胞(稱為允許細胞/ Permissive cell) 中建立終生潛伏感染。潛伏態(tài)CMV 能通過一個痕量反復(fù)激活的機制,誘導(dǎo)宿主發(fā)生反復(fù)痕量的免疫應(yīng)答,累積形成免疫衰老,其主要累及T 細胞的適應(yīng)性免疫衰老。 免疫衰老是老年人高發(fā)病率和高死亡率的核心機制之一。傳統(tǒng)定義的病毒潛伏期,是在不產(chǎn)生子代病毒的情況下維持病毒基因組,但具有為隨后的幾輪復(fù)制而重新激活的能力。 在潛伏期中,病毒僅轉(zhuǎn)錄有限數(shù)量的病毒RNA,蛋白質(zhì)和microRNA。 人類巨細胞病毒(HCMV)潛伏在骨髓干細胞中,具有干細胞分化依賴的基因累積表達特點,它的潛伏期激活機制,更為復(fù)雜[9]。 在普通人群中,CMV 的痕量反復(fù)激活能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答,但是宿主無法識別清除病毒潛伏庫,這種痕量激活也不能導(dǎo)致宿主發(fā)生急性疾病。 這種 “病毒―宿主” 之間存在的百萬年共進化, 產(chǎn)生了復(fù)雜的共生( Co-pathogen)機制。

CMV 在骨髓的痕量機會, 伴隨全能干細胞(CD34+CD14-)分化為單核系前驅(qū)/ 祖細胞(CD34+CD14+),并且繼續(xù)分化為單核/ 樹突細胞( CD34-CD14+)[9-10]的過程[5,11]。 大型DNA 病毒CMV 就是通過這種近乎完美的免疫逃避機制[12],將病毒從潛伏庫干細胞,傳遞至到抗原提呈DC 細胞/ 單核細胞中。 而且,骨髓干細胞中的CMV 潛伏細胞比例很低,應(yīng)用PCR 結(jié)合原位雜交技術(shù),預(yù)測其潛伏細胞陽性率約為1 ∶10000 ～25000,每個潛伏感染細胞的CMV 拷貝數(shù)為2 ～13 個基因組[13]。 即使應(yīng)用基于單細胞的高敏感數(shù)字PCR,能提高人群的的陽性率,使接近一半的HCMV 潛伏攜帶的骨髓干細胞中檢測到病毒基因組,但是細胞基因組的檢測陽性率,也少于10 / 10000 個細胞[14]。 此外,通過檢測外周血中極少量干細胞來源的CD14+CMV 潛伏細胞中的CMV 基因載量,并未發(fā)現(xiàn)CMV 潛伏感染率的年齡相關(guān)[14],這提示潛伏態(tài)CMV 的痕量激活量,是一個與宿主免疫功能息息相關(guān)的互作機制。 目前的研究結(jié)果顯示,潛伏態(tài)CMV 在分化偶聯(lián)的痕量激活過程中,未檢測到足夠量的病毒轉(zhuǎn)錄本和蛋白表達(無法通過普通PCR 或者Western blot 檢測到),也未檢測到細胞表面表達的病毒特征性蛋白(無法通過流式細胞術(shù)檢測),這為潛伏態(tài)CMV 痕量反復(fù)激活誘導(dǎo)免疫衰老的機制,提出了嚴峻的挑戰(zhàn)。

2 骨髓潛伏態(tài)巨細胞病毒痕量反復(fù)激活體外實驗的單細胞研究進展

CMV 的潛伏庫建立在骨髓全能造血干細胞中,而骨髓造血干細胞是一個具有動態(tài)分化程序的異質(zhì)細胞群,而且對體外刺激很敏感。 這些CD34+造血干細胞分化依賴的細胞群中,僅很小一部分攜帶CMV 轉(zhuǎn)錄本, 且始終伴隨干細胞的分化, 潛伏態(tài)HCMV 逐步發(fā)生了痕量復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的動態(tài)變化。 由于骨髓潛伏態(tài)CMV 的病毒載量和表達水平均極低,加上攜帶CMV 基因組的骨髓細胞群具有動態(tài)變化特點,宿主的免疫功能又顯著影響 “病毒-宿主” 的互作模式,因此,應(yīng)用單細胞RNA 測序進行CMV 基因表達的探索,具有突破的意義。 一個單細胞測序分析數(shù)據(jù)顯示,25 名CMV 血清陽性的造血干細胞轉(zhuǎn)錄本庫(1.5×1010序列),未能成功比對獲取CMV序列[15]。 進一步比對基因組織表達( Genotype-Tissue Expression / GTEx)數(shù)據(jù)庫,一個收集人類健康尸檢組織RNA 測序信息的數(shù)據(jù)庫,對31 個組織549 個樣本(> 4.33 ×1012核苷酸)進行CMV 序列比對,僅從40 個樣本中比對得到了潛伏期激活基因( Immediate Early / IE ) 基 因 的 序 列[15]。 體 外 對3.655 個原代感染CMV 的CD14+細胞進行經(jīng)時(time-dependent)單細胞測序,分別構(gòu)建宿主和病毒轉(zhuǎn)錄本庫,發(fā)現(xiàn)CMV 的痕量激活僅發(fā)生在一個特定表達細胞集落刺激因子的細胞亞群,這些細胞富含線粒體激活基因,細胞增殖基因,RNA 加工基因和蛋白質(zhì)合成基因,且始終保持較高轉(zhuǎn)錄水平;同時,干擾素相關(guān)基因的表達下調(diào),提示CMV 發(fā)生集落刺激和分化誘導(dǎo)的激活[16]。 此外,這些單細胞數(shù)據(jù)顯示CMV 從早期痕量表達狀態(tài)逐漸演進為病毒裂解和大量表達,是否存在一個演進門檻值需要深入研究[15]。 需要指出的是,體外原代感染的CD14+細胞,主要顯示骨髓干細胞分化偶聯(lián)的從痕量潛伏期過渡至大量激活期的轉(zhuǎn)錄本的后期過程,無法模擬慢性潛伏態(tài)CMV 分化偶聯(lián)的痕量激活轉(zhuǎn)錄特點[15]。 Galinato 等[16]對原代感染的7.000 個骨髓干細胞進行單細胞測序,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)干細胞中檢測到了CMV 的DNA 序列,表明病毒的入侵潛伏不受限制,其激活可能受到宿主的限制。 Shnayder 等[17]分別檢測了造血干細胞(HSPC)和多系祖細胞中的CMV 轉(zhuǎn)錄本,證實CMV 轉(zhuǎn)錄僅在造血干細胞的單核細胞祖細胞中檢測得到,且與宿主抗病毒免疫應(yīng)答降低有關(guān)。 這些單細胞RNA 測序數(shù)據(jù),明確了潛伏態(tài)CMV 干細胞分化誘導(dǎo)的痕量激活機制。

3 巨細胞病毒激活誘導(dǎo)外周血免疫衰老的單細胞水平研究進展

T 細胞受體(TCR)提供的抗原特異性細胞毒性T 細胞,是宿主抗病毒的核心機制。 這些TCR 多樣性通過一個建立在基因重排基礎(chǔ)上的單個細胞抗原特異性受體儲備庫實現(xiàn)。 因此,TCR 多樣性儲備的逐漸降低,是T 細胞免疫衰老的核心機制。 巨大DNA 病毒CMV 的痕量反復(fù)激活,能誘導(dǎo)產(chǎn)生外周血最龐大的TCR 記憶效應(yīng)T 細胞克隆擴增。Atsushi 等利用熒光標記的抗原肽四聚體技術(shù),結(jié)合高識別度單細胞微矩陣,篩選人CMV 的抗原特異性TCRβ 儲備庫,獲取了外周血比例約0.05% ～8.5%的CMV-pp65 克隆擴增[18]。 檢測感染鼠巨細胞病毒(MCMV)的小鼠脾以及腸道淋巴組織中病毒特異性T 細胞,得到了MCMV 特異性記憶效應(yīng)CD8+T 細胞的單細胞轉(zhuǎn)錄譜[19],這些腸道淋巴組織內(nèi)的循環(huán)CD8+T 記憶細胞(TPM)克隆擴增相關(guān)基因(KLRC1,KLRK1(NKG2D),KLRG1,CX3CR1) 以及常駐記憶T 細胞( resident memory T-cells ( TRM), S1PR1,S1PR5,ITGAE,KLRG1) 相關(guān)基因存在交互表達。與循環(huán)記憶T 細胞高表達CX3CR1 而不表達KLRG1 相比,CMV 抗原激活的T 細胞克隆顯示出相對靜止( activated yet resting) 的免疫衰老相關(guān)特點,即高表達KLRG1 和CX3CR1。 通過外周血TCR的單細胞數(shù)據(jù),進一步證實了CMV 反復(fù)痕量激活誘導(dǎo)T 細胞免疫衰老的特點[19]。 研究者比較了潛伏感染MCMV 的老年小鼠和無MCMV 潛伏的老年鼠針對新抗原( OVA) 的特異性CD8+T 細胞受體β(TCRβ)轉(zhuǎn)錄本,克隆擴增多樣性最廣泛的宿主,是老年MCMV 潛伏感染小鼠,這些小鼠識別新抗原肽的能力更高;老年MCMV 潛伏感染的小鼠發(fā)生了針對OVA 的強烈適應(yīng)性T 細胞免疫應(yīng)答,而無MCMV潛伏感染的小鼠,其TCR 多樣性明顯降低。 這些單細胞數(shù)據(jù)提示,潛伏態(tài)CMV 痕量反復(fù)激活可能對老年人群的適應(yīng)性免疫發(fā)揮 “疫苗樣” 積極影響,證實了與宿主長期共進化的病毒與宿主衰老之間的復(fù)雜關(guān)系[20]。 另一個單細胞RNA 測序研究則顯示,針對新抗原入侵的高親和力TCR 在TCR 組譜(TCR repertoire)中優(yōu)先擴增,這種進化依賴的親和力適應(yīng)性,能被潛伏態(tài)CMV 的反復(fù)痕量激活削減[21]。 因此,為了揭示宿主共進化CMV 的終身潛伏激活,宿主TCR 多樣性和TCR 親和力,以及新抗原入侵的T細胞免疫應(yīng)答之間的關(guān)系,需要更多基于單細胞RNA 測序的研究數(shù)據(jù)。 外周血人類自然殺傷(NK)細胞也在免疫衰老中也發(fā)揮重要作用,由于NK 的功能細胞表型非常復(fù)雜,通過對NK 細胞進行單細胞測序,能獲取伴有或不伴有CMV 潛伏感染的NK細胞表型差異表達譜。 CMV 的潛伏感染能顯著改變NK 細胞的功能集簇,提高適應(yīng)性NK 亞群的比例,誘導(dǎo)CMV 適應(yīng)性的NK 應(yīng)答[22]。

4 針對骨髓CMV 潛伏感染調(diào)控機制的單細胞研究展望

通過單細胞的研究,研究者發(fā)現(xiàn)骨髓CMV 潛伏期的轉(zhuǎn)錄,其實并非休眠和沉默[1,23],越來越多的CMV 潛伏期轉(zhuǎn)錄信息通過單細胞技術(shù)的改良而獲得。 需要指出的是,普通單細胞測序平臺僅提供基因表達的 “快照”,無法動態(tài)傳達轉(zhuǎn)錄的過程,而且每個單個細胞的RNA 譜只能分析一次,因此,大部分體外原代感染的CD14+細胞內(nèi)未測到CMV 的基因表達(< 0.1% HCMV 讀數(shù))。 這個結(jié)果或提示CMV 基因組受到高度抑制,或者提示該細胞并未被感染,因為骨髓干細胞中的CMV 細胞陽性率很低。同時, CD34+干細胞的病毒轉(zhuǎn)錄水平, 顯著低于CD14+細胞,提示骨髓干細胞能抑制CMV 的激活。為了鑒別低水平CMV 轉(zhuǎn)錄本是 “ 真正的” 的零轉(zhuǎn)錄,還是初始潛伏在干細胞病毒拷貝比例低,需要動態(tài)比較CD34+干細胞與CD14+單核細胞的單細胞轉(zhuǎn)錄譜。 這種同時描繪病毒和宿主異質(zhì)性的單細胞RNA 測序平臺,能夠揭示宿主細胞環(huán)境與病毒基因表達之間的功能聯(lián)系,已經(jīng)用于多個 “ 宿主-病毒” 互作研究,對宿主免疫應(yīng)答的復(fù)雜性和病毒的細胞允許性,提出了很多新穎的見解[16,24-30]。

需要指出的是,針對無偏見轉(zhuǎn)錄組的單細胞測序敏感度,需要細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄≥50000 個核苷酸序列[31],很多病毒低水平激活達不到這個水平。 骨髓CMV 的痕量激活轉(zhuǎn)錄組,甚至低于1.0000 個核苷酸,這導(dǎo)致單細胞測序的數(shù)據(jù)稀疏( sparsity of the data), 即零讀數(shù)的占比( proportion of zero read counts)過高[32-33]。 “稀疏” 的病毒轉(zhuǎn)錄本很可能因為低豐度表達而 “ 被棄( dropouts)”[32]。 通過基于單細胞的液滴樣數(shù)字PCR(Droplet digital PCR,DDPCR),理論能夠測到低于100 個核苷酸的轉(zhuǎn)錄本,從而檢測到極低水平的核苷酸拷貝數(shù)[34]。 然而,單細胞測序,無論單細胞RNA 測序,還是單細胞DDPCR,均存在固有的隨機性,需要加強樣品的質(zhì)控和標準化。 基于唯一分子標識符(UMI) 技術(shù),理論上可以消除測序深度偏差[35],但是UMI 仍然無法解決捕獲效率或細胞mRNA 含量差異的問題。

伴隨單細胞測序技術(shù)的迭代,用光反應(yīng)核苷類似物(4sU) 進行核苷代謝標記(U-to-C conversion)的單細胞測序(scSLAM-seq),通過區(qū)分生化核苷代謝程度(轉(zhuǎn)錄順序的早晚),對每個細胞中數(shù)千個基因的轉(zhuǎn)錄活性(核苷生化代謝程度) 和表達差異進行同步可視化。 用scSLAM-seq 動態(tài)檢測小鼠成纖維細胞中巨細胞病毒原代感染的細胞轉(zhuǎn)錄本,能建立宿主轉(zhuǎn)錄動力學(xué)( TBP-TATA-box 相互作用和DNA 甲基化)相關(guān)的基因表達差異,通過RNA 轉(zhuǎn)錄時間(新舊程度)推斷細胞周期狀態(tài),結(jié)合病毒感染劑量,獲取由CMV 感染誘導(dǎo)所致的單個細胞之間的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性,得到病毒相關(guān)的宿主轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù),是目前針對CMV 轉(zhuǎn)錄的最全面數(shù)據(jù)[36]。 總之,單細胞測序研究平臺的發(fā)展和迭代,為揭示潛伏態(tài)CMV痕量反復(fù)激活誘導(dǎo)免疫衰老的復(fù)雜調(diào)控機制,展示了光明的前景。