動(dòng)物生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急管理經(jīng)驗(yàn)交流

林凱麗,劉梅軒,麻昊然,潘思丹,喬紅偉,高虹

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京 100021)

目前,新型冠狀病毒性肺炎(COVID-19)在全球呈現(xiàn)爆發(fā)式流行,截止2020 年7 月初,全球已經(jīng)有196 個(gè)國(guó)家出現(xiàn)COVID-19 病例,累計(jì)確診病例達(dá)到1163 萬(wàn)人。 在COVID-19 暴發(fā)初期,對(duì)新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的生物學(xué)特性、流行病學(xué)特征、致病性、COVID-19 臨床表現(xiàn)等尚不明確,預(yù)防和治療手段也亟待解決,為加強(qiáng)對(duì)SARS-CoV-2 的認(rèn)識(shí),有效開(kāi)發(fā)特異性診斷試劑,系統(tǒng)的評(píng)價(jià)機(jī)體的免疫網(wǎng)絡(luò)及組織病變,為臨床診斷、預(yù)防與治療、疫苗與藥物的篩選提供詳細(xì)的參考資料,開(kāi)展病毒分離和動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)迫在眉睫。 根據(jù)目前所掌握的基本信息,該病原暫按照病原微生物危害程度分類第二類病原微生物進(jìn)行管理,病毒培養(yǎng)和動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)均應(yīng)當(dāng)在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作[1]。

為應(yīng)對(duì)新發(fā)再發(fā)傳染病、防范生物恐怖襲擊、防御生物武器攻擊,我國(guó)已經(jīng)規(guī)劃并建成一批高等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室,作為國(guó)家生物安全體系的基礎(chǔ)支撐平臺(tái),為人口健康與動(dòng)物衛(wèi)生領(lǐng)域開(kāi)展科研、生產(chǎn)和服務(wù)提供重要保障條件[2]。 在對(duì)SARS-CoV-2 有限認(rèn)知的前提下,如何迅速、高效、有序的開(kāi)展SARS-CoV-2 應(yīng)急實(shí)驗(yàn)活動(dòng),最大程度的控制潛在風(fēng)險(xiǎn),保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員健康與安全,保障實(shí)驗(yàn)室正常運(yùn)轉(zhuǎn),除了硬件設(shè)施外,規(guī)范化的管理措施也是生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室安全運(yùn)行的重要保障。

1 生物安全管理措施

系統(tǒng)、規(guī)范化的管理措施是生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室高效、有序運(yùn)行的重要保障,是降低實(shí)驗(yàn)室意外事故發(fā)生的關(guān)鍵要素。 開(kāi)展實(shí)驗(yàn)活動(dòng)前,實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)充分了解實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)涉及的任何危險(xiǎn),由于人類對(duì)SARS-CoV-2 的有限認(rèn)知,無(wú)法對(duì)其進(jìn)行充分的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,因此管理部門(mén)應(yīng)采取恰當(dāng)?shù)墓芾泶胧?并為實(shí)驗(yàn)人員提供如何在風(fēng)險(xiǎn)最小情況下進(jìn)行工作的詳細(xì)指導(dǎo)[3],包括人員管理、活動(dòng)管理、設(shè)施設(shè)備管理、消毒滅菌及意外事故處理等。

1.1 人員管理

在SARS-CoV-2 應(yīng)急研究工作中,人員管理是保證實(shí)驗(yàn)室安全、有效運(yùn)行的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 開(kāi)展實(shí)驗(yàn)活動(dòng)前,首先應(yīng)成立法人負(fù)責(zé)的應(yīng)急團(tuán)隊(duì),包括技術(shù)負(fù)責(zé)人、安全管理人員和項(xiàng)目負(fù)責(zé)人在內(nèi),落實(shí)組織管理責(zé)任,密切追蹤疫情的發(fā)展情況,完善風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、制定研究方案、分析研究結(jié)果、協(xié)調(diào)應(yīng)急物資、調(diào)撥實(shí)驗(yàn)人員,還要密切關(guān)注實(shí)驗(yàn)人員的工作狀態(tài),及時(shí)做好人員的心理疏導(dǎo)和技術(shù)培訓(xùn)。

項(xiàng)目組成員最好具有動(dòng)物生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室研究背景,熟練掌握病毒培養(yǎng)、動(dòng)物飼養(yǎng)和感染的基本操作程序,充分了解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的習(xí)性,降低抓傷咬傷、動(dòng)物逃逸等風(fēng)險(xiǎn),必要時(shí)可佩戴防抓咬手套。 非人靈長(zhǎng)類是研究SARS-CoV-2 理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一,由于其體格較大、生理結(jié)構(gòu)復(fù)雜,芯片植入、肺泡灌洗、動(dòng)物解剖等操作對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)造成極大的挑戰(zhàn),因此要求實(shí)驗(yàn)人員具有扎實(shí)的操作基礎(chǔ)。 其次,加強(qiáng)人員持續(xù)培訓(xùn),不僅能夠鞏固人員的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),還能夠提高警惕性、加強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)意識(shí),培訓(xùn)重點(diǎn)不僅要包括人員防護(hù)、實(shí)驗(yàn)室風(fēng)險(xiǎn)、意外事故處理、廢棄物的處置、清場(chǎng)消毒和緊急撤離等方面,還要階段性總結(jié)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)基本情況,及時(shí)反思前期出現(xiàn)的問(wèn)題。 再次,管理人員要關(guān)注人員的身體健康和心理健康,通過(guò)交流與實(shí)驗(yàn)人員建立良好的互信關(guān)系,充分了解實(shí)驗(yàn)人員所承受得工作壓力和生活壓力,使其避免受到任何不利于其工作質(zhì)量的壓力或影響。

在應(yīng)急工作中,往往時(shí)間緊、任務(wù)重,多個(gè)核心實(shí)驗(yàn)室同時(shí)開(kāi)展試驗(yàn)活動(dòng),應(yīng)有制度明確規(guī)定不同核心實(shí)驗(yàn)室的研究人員退出時(shí)間需錯(cuò)開(kāi)半小時(shí)以上,以使公共區(qū)域得到充分自凈。 由于疾病流行初期,對(duì)COVID-19 缺乏有效的預(yù)防和治療方案,因此實(shí)驗(yàn)活動(dòng)前,人員要留取本底血清;實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,階段性采集咽拭子檢測(cè)核酸,如發(fā)生意外事故,一旦檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性或出現(xiàn)與SARS-CoV-2 有關(guān)的臨床癥狀時(shí),應(yīng)立即上報(bào)、隔離、就診。

1.2 實(shí)驗(yàn)活動(dòng)管理

SARS-CoV-2 與SARS-CoV 相似性達(dá)到79.6%,通過(guò)細(xì)胞膜表面ACE2 受體進(jìn)入細(xì)胞[4],我國(guó)暫時(shí)按照第二類病原微生物管理。 值得注意的是,《SARS-CoV-2 實(shí)驗(yàn)室生物安全指南》 中明確指出未經(jīng)培養(yǎng)的感染性材料操作可在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室中操作,同時(shí)采用三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人防護(hù)[1],因此實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急管理可參考SARS-CoV,遵循 “防護(hù)加強(qiáng)、程序減少” 的基本原則。

SARS-CoV-2 主要傳播途徑是呼吸道飛沫和接觸傳播,不排除氣溶膠、消化道和結(jié)膜感染等傳播途徑,因此除生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室基本的防護(hù)外,實(shí)驗(yàn)人員必須佩戴一次性N95 醫(yī)用防護(hù)口罩、護(hù)目鏡或者一次性面罩,佩戴N95 口罩可能存在邊緣漏氣的情況,因此每次佩戴時(shí)需要進(jìn)行簡(jiǎn)易的吹氣檢驗(yàn),根據(jù)操作者鼻部尺寸自行調(diào)整防護(hù)口罩的鼻金屬夾,吹一口氣,感覺(jué)口罩邊緣是否漏氣,保證呼出和吸入氣體確實(shí)通過(guò)口罩過(guò)濾。 實(shí)驗(yàn)人員每年需要進(jìn)行N95 口罩的個(gè)體適配性檢測(cè),應(yīng)同時(shí)適配兩款以上的口罩,當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間開(kāi)展實(shí)驗(yàn)活動(dòng)時(shí)可交替使用,避免人員臉部壓痕難以恢復(fù)的情況。 在實(shí)際使用過(guò)程中,護(hù)目鏡不僅容易起霧,而且反復(fù)消毒會(huì)導(dǎo)致鏡片模糊,影響人員操作安全和舒適性,因此推薦佩戴一次性防護(hù)面罩。 當(dāng)實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物解剖實(shí)驗(yàn)時(shí),可能存在因動(dòng)物咳嗽或排泄形成的大量氣溶膠或噴濺現(xiàn)象,實(shí)驗(yàn)人員可以佩戴半身電送風(fēng)正壓防護(hù)裝置,外穿一次性手術(shù)反穿衣,方便污染后隨時(shí)更換。

應(yīng)急工作期間,實(shí)驗(yàn)室仍然要按管理要求執(zhí)行實(shí)驗(yàn)活動(dòng)申請(qǐng)、審批制度,管理部門(mén)嚴(yán)格審查風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和標(biāo)準(zhǔn)操作程序、人員資質(zhì)、病原種類、動(dòng)物種類和實(shí)驗(yàn)活動(dòng)內(nèi)容,鑒于實(shí)驗(yàn)活動(dòng)較多,同一項(xiàng)目可提交一個(gè)較長(zhǎng)周期的實(shí)驗(yàn)室使用申請(qǐng),減少項(xiàng)目組的申請(qǐng)壓力,但是每次進(jìn)動(dòng)物前,項(xiàng)目組均需要提交經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)( IACUC) 批準(zhǔn)的動(dòng)物使用申請(qǐng),確保管理部門(mén)掌握實(shí)驗(yàn)活動(dòng)進(jìn)展和動(dòng)物飼養(yǎng)情況,合理安排飼養(yǎng)籠位,協(xié)調(diào)各項(xiàng)目組實(shí)驗(yàn)時(shí)間。 實(shí)驗(yàn)活動(dòng)中,病毒培養(yǎng)要嚴(yán)格控制單次的操作數(shù)量,建議少量多次,縮短操作時(shí)間,生物安全柜內(nèi)從左到右依次分為潔凈區(qū)、工作區(qū)和污物區(qū),不能遮擋排風(fēng)口以免影響氣流或引發(fā)設(shè)備報(bào)警。動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)可以根據(jù)單次感染動(dòng)物的數(shù)量,增加進(jìn)入人數(shù),比如平時(shí)進(jìn)入2 個(gè)人操作3 h 左右,應(yīng)急期間可同時(shí)進(jìn)入3～4 個(gè)人縮短操作時(shí)間,或者輪流操作,降低因人員疲倦發(fā)生意外的概率,每次進(jìn)入時(shí)間嚴(yán)格控制在4 h 以內(nèi)。 為了減少人員在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的停留時(shí)間,實(shí)驗(yàn)前要制定完整的方案,包括給藥劑量、感染劑量和給藥途徑等,做好充分的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備;實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,除病理解剖、動(dòng)物臨床觀察等必須現(xiàn)場(chǎng)完成的記錄外,儀器設(shè)備記錄、感染性材料記錄等可在離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室后補(bǔ)齊。

1.3 設(shè)施設(shè)備管理

設(shè)施設(shè)備是開(kāi)展SARS-CoV-2 實(shí)驗(yàn)活動(dòng)的基礎(chǔ)保障,在實(shí)驗(yàn)室正常運(yùn)轉(zhuǎn)的情況下,開(kāi)關(guān)門(mén)、局部排風(fēng)設(shè)備的啟停以及房間溫濕度的變化等因素均能夠引起房間的壓力波動(dòng),在滿足現(xiàn)有生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范和設(shè)備生物安全性能評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范的前提下,可根據(jù)實(shí)際情況提高設(shè)施運(yùn)行的參數(shù),以增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)壓力波動(dòng)的抗干擾能力,如增大房間換氣次數(shù),增加實(shí)驗(yàn)室換氣次數(shù)到每小時(shí)15次或每小時(shí)20 次,通過(guò)增大換氣次數(shù)提高房間凈化能力。

病毒培養(yǎng)、動(dòng)物觀察和解剖等常用設(shè)備是生物安全柜和負(fù)壓解剖臺(tái),選用II 級(jí)A 型以上級(jí)別生物安全柜,部分生物安全柜可通過(guò)調(diào)節(jié)送排風(fēng)按鈕增大系統(tǒng)送排風(fēng)量,在生物安全柜內(nèi)的工作開(kāi)始前和結(jié)束后,增加風(fēng)機(jī)運(yùn)行時(shí)間至10 min,保證工作前氣流穩(wěn)定和工作結(jié)束后安全柜內(nèi)空氣的凈化程度,工作結(jié)束后,增加紫外燈照射時(shí)間。 由于非人靈長(zhǎng)類體格較大、呼吸量較大,感染后呼出氣體能夠產(chǎn)生氣溶膠,建議使用生物安全型飼養(yǎng)設(shè)備,可增加設(shè)備換氣次數(shù),降低實(shí)驗(yàn)人員飼養(yǎng)過(guò)程中的暴露風(fēng)險(xiǎn)。

1.4 清場(chǎng)消毒

實(shí)驗(yàn)室清場(chǎng)消毒是保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員、實(shí)驗(yàn)環(huán)境和外部環(huán)境的重要環(huán)節(jié)。 所有移出實(shí)驗(yàn)室的物品都需要經(jīng)過(guò)消毒處理,注明廢棄物類別、處理時(shí)間、處理人員等基本信息,放到專門(mén)設(shè)計(jì)的、專用的和有標(biāo)識(shí)的危險(xiǎn)廢物處置容器中[1],集中回收后按照要求處理。 高壓蒸汽滅菌是生物安全實(shí)驗(yàn)室消毒滅菌的首選方法,適用于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)產(chǎn)生的廢棄物、動(dòng)物尸體、墊料等,對(duì)于不能高壓的物品,比如儀器設(shè)備、動(dòng)物標(biāo)本等使用化學(xué)消毒法。

由于SARS-CoV-2 傳染性強(qiáng)、生物學(xué)特性尚不明確,建議在實(shí)驗(yàn)活動(dòng)操作中增加消毒頻次,延長(zhǎng)消毒劑作用時(shí)間,有效氯含量為0.55%的含氯消毒劑是新型冠狀病毒的首選消毒劑[5]。 在操作感染性材料或動(dòng)物解剖實(shí)驗(yàn)活動(dòng)前,需要在操作臺(tái)面鋪一次性吸水墊,表面噴灑不易揮發(fā)的消毒劑,一旦發(fā)生感染性材料的滴落,能夠被迅速吸附消毒。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,操作人員切勿將手頻繁移出生物安全柜,操作結(jié)束后對(duì)手部進(jìn)行消毒,更換外層手套后,才能移出生物安全柜。

甲醛熏蒸是目前公認(rèn)的能夠殺死所有微生物的消毒方法,由于其極大的刺激性和致癌風(fēng)險(xiǎn)以及對(duì)設(shè)施設(shè)備的損害,一般情況下不推薦使用,但是當(dāng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備故障出現(xiàn)壓力逆轉(zhuǎn)等現(xiàn)象,有潛在泄露風(fēng)險(xiǎn)時(shí),應(yīng)該立即終止實(shí)驗(yàn),封閉實(shí)驗(yàn)室,在室溫不低于21℃、 相對(duì)濕度70% 的條件下使用甲醛(40%)10 mL/ m3熏蒸4 h 以上,作用時(shí)間需達(dá)到8 h 以上[1],保障實(shí)驗(yàn)人員、實(shí)驗(yàn)環(huán)境和外界環(huán)境的安全。

1.5 意外事故的預(yù)防與處理

在ABSL-3 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)從事動(dòng)物實(shí)驗(yàn)活動(dòng)時(shí),潛在的意外事故包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)器材扎傷,動(dòng)物抓傷、咬傷,感染性物質(zhì)溢灑,動(dòng)物逃逸,個(gè)人防護(hù)裝備污染等,因此實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定恰當(dāng)?shù)念A(yù)防措施和處置方案。 比如為了避免人員扎傷,注射器排空時(shí)禁止蓋帽,可以在針頭上扎一個(gè)酒精棉球,吸附排空過(guò)程產(chǎn)生的氣溶膠;為了避免動(dòng)物抓傷、咬傷,抓取動(dòng)物時(shí)需佩戴防抓咬手套或者在動(dòng)物麻醉狀態(tài)下進(jìn)行操作;為防止感染性物質(zhì)溢灑而引起實(shí)驗(yàn)室污染,核心間應(yīng)配備溢灑工具箱( 內(nèi)含毛巾、消毒劑、鑷子、量杯、禁止進(jìn)入的標(biāo)識(shí)等),實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入核心間后應(yīng)配置消毒液,將毛巾浸泡在里面,一旦發(fā)生感染性物質(zhì)溢灑,立即用浸有消毒液的毛巾覆蓋,消毒防護(hù)裝備表面后打開(kāi)紫外燈離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室,待核心間充分自凈后再返回處理;為了防止動(dòng)物逃逸,核心間應(yīng)配備捕捉桶和捕捉網(wǎng),分別用于捕捉嚙齒類動(dòng)物和體型較大的動(dòng)物,嚙齒類動(dòng)物跌落至地面時(shí)會(huì)有3 秒鐘左右的反應(yīng)延遲,實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)充分利用該機(jī)會(huì)進(jìn)行捕捉。

2 結(jié)語(yǔ)

在全國(guó)爆發(fā)COVID-19 疫情的時(shí)期,生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室為人類認(rèn)識(shí)病毒、有效開(kāi)發(fā)診斷試劑、系統(tǒng)評(píng)價(jià)機(jī)體的免疫網(wǎng)絡(luò)及組織病變等方面提供了重要的硬件設(shè)施保障條件。 但是再好的硬件設(shè)施保障、再完美的防護(hù)條件,在實(shí)際操作層面上是無(wú)法取代人員自身的素質(zhì)和責(zé)任心,完善的管理措施能夠有效地預(yù)防實(shí)驗(yàn)室生物安全事故的發(fā)生,是實(shí)驗(yàn)室安全、穩(wěn)定、有效運(yùn)行的重要保障。 因此,我們需要不斷完善應(yīng)急措施,從實(shí)驗(yàn)人員、實(shí)驗(yàn)活動(dòng)、設(shè)施設(shè)備、清場(chǎng)消毒和意外事故的預(yù)防與處理等幾個(gè)方面加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室管理,保障實(shí)驗(yàn)室安全、穩(wěn)定、有效的運(yùn)行,為早日戰(zhàn)勝疫情貢獻(xiàn)自己的力量。