PD-1在巨噬細胞中的表達及對其功能的調(diào)控

江懿佳 王青青 劉 楊

(浙江大學醫(yī)學院免疫學研究所，杭州 310058)

淋巴細胞活化受共刺激分子和共抑制分子共同調(diào)節(jié)，這些抑制性分子稱為免疫檢查點，即免疫系統(tǒng)活化保持在正常范圍之內(nèi)的關鍵點[1]。T細胞通過T細胞受體(T cell receptor，TCR)識別抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)上的抗原肽——主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)復合物，與此同時T細胞共刺激分子CD28與APC上的CD80(B7.1)或CD86(B7.2)相互作用，提供共刺激信號，導致T細胞活化[2]。在早期T細胞活化中，細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4,CTLA-4)作為免疫檢查點，直接與CD28競爭結合CD80和CD86下調(diào)免疫應答[3]。而另外一個免疫分子檢查點——程序性死亡受體(programmod cell death-1 recepter,PD-1)，在維持免疫平衡和免疫耐受上也有重要作用。然而，在慢性疾病和腫瘤發(fā)生時，PD-1會限制保護性免疫，從而導致免疫逃逸。PD-1與相應配體結合后，會抑制CD28導致的T細胞活化、增殖及細胞因子的產(chǎn)生并可能導致T細胞凋亡[4]。PD-1還可抑制B細胞受體(B cell receptor,BCR)介導的B細胞活化，從而抑制B淋巴細胞的增殖和抗體的生成[5]。PD-1的既往研究主要集中于淋巴細胞，近年來發(fā)現(xiàn)其在巨噬細胞固有免疫應答中也發(fā)揮重要作用。

1 PD-1的結構和表達

PD-1即CD279，是由288個氨基酸組成的Ⅰ型跨膜蛋白受體，屬于CD28免疫球蛋白(Ig)超家族，由三個結構域組成，分別為免疫球蛋白樣結構域、疏水跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。胞內(nèi)區(qū)由免疫受體酪氨酸轉換基序ITSM(immunoreceptor tyrosine-based switch motif)和免疫受體酪氨酸抑制基序ITIM(immunor-eceptor tyrosine-based inhibitory motif)組成[6]。PD-1主要表達于T淋巴細胞和前體B淋巴細胞，在初始T細胞上不表達，在接觸外來抗原或自身抗原后，初始T細胞被活化從而表達PD-1[7]。PD-1的表達程度與抗原刺激程度相關，當抗原被立刻清除(如在急性疾病發(fā)生)時，相應T細胞上的PD-1表達量減少；而在慢性感染或者腫瘤中，由于抗原的持續(xù)刺激，T細胞上PD-1可持續(xù)高表達[8,9]。PD-1在細胞表面的表達可在刺激后24 h內(nèi)檢測，但在T淋巴細胞活化幾小時內(nèi)就可發(fā)揮功能[10]。除了T、B淋巴細胞外，PD-1還可表達于NK細胞(natural killer cells)、NKT(natural killer T cells)、活化單核細胞，樹突狀細胞DCs(dendritic cells)等髓系細胞、APC細胞及腫瘤細胞和固有淋巴細胞[6，11，12]。PD-1在活化T淋巴細胞上的表達主要受NFATC1(nuclear factor of activated T cells，cytoplasmic 1)、FOXO1 (forkhead box protein O1)，T-bet(T-box expressed T-cells)和BLIMP1 (B lymphocyte-induced maturation protein 1)等轉錄因子調(diào)控[13]。此外，PD-1表達可能還受表觀修飾調(diào)控，使其在抗原被清除后還能持續(xù)表達，但具體機制還有待深入研究[14]。在腫瘤微環(huán)境中，PD-1表達上調(diào)，其配體表達水平也會隨之增高[15]。

2 PD-1配體

PD-1通過與其配體PD-L1(programmed death-ligand 1，即B7-H1，CD274)和PD-L2(即B7-DC)結合發(fā)揮功能[16]。PD-L1和PD-L2主要區(qū)別在于其表達模式。PD-L1廣泛表達于各種細胞，其在淋巴細胞、DC細胞和巨噬細胞等造血細胞和血管內(nèi)皮細胞及各種腫瘤細胞系等非造血細胞上均有分布[6，17]。前炎癥因子如Ⅰ型和Ⅱ型干擾素、TNF-α、IL-27等都可促進PD-L1表達[18，19]。以干擾素為代表的細胞因子是PD-L1的主要調(diào)節(jié)分子，其在腫瘤中會形成適應性免疫耐受，即由T淋巴細胞等產(chǎn)生的前炎癥因子會上調(diào)PD-L1表達，是PD-1/PD-L1作為免疫檢查點的重要負反饋機制。PD-L2的表達相較于PD-L1相對局限，其主要分布于DC細胞、巨噬細胞、B細胞和骨髓來源肥大細胞，可被一些細胞因子誘導表達，如IL-4、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和IFN-γ等[20-22]。PD-L1和PD-L2與PD-1的親和力也不同，PD-L2與PD-1結合親和力約為PD-L1的3倍[17]。

3 PD-1胞內(nèi)信號和分子機制

PD-1信號通路的研究主要在活化T淋巴細胞內(nèi)進行。PD-1通過與其配體結合導致ITSM/ITIM基序磷酸化，從而招募酪氨酸磷酸酶(SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-1，SHP-1)和SHP-2，SHP-1和SHP2可通過使相應激酶去磷酸化從而抑制這些激酶活化，比如可通過抑制PI3K-Akt(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B)通路及磷脂酶C-γ1(phospholipase C-γ1,PLC-γ1)和其下游的有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路抑制TCR受刺激后導致的T細胞存活、活化、增殖、細胞因子的產(chǎn)生及細胞內(nèi)代謝改變，提示PD-1在T細胞免疫耐受和腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要功能[4，17，23，24]。

4 巨噬細胞的分類和功能

巨噬細胞功能的多樣性導致其存在多種分類方式。根據(jù)其免疫功能可分為M1型巨噬細胞即經(jīng)典激活的巨噬細胞(classically activated macrophages)和M2型巨噬細胞即替代激活的巨噬細胞(alternatively activated macrophages)[25]。M1型巨噬細胞在IFN-γ、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、GM-CSF等刺激下分泌IL-1β、TNF-α及IL-12等促炎癥因子，協(xié)助Th1細胞發(fā)揮抗感染功能[26]。M2型巨噬細胞是在Th2細胞分泌的細胞因子如IL-4和IL-13等作用下分化形成，主要參與纖維化、組織修復和體液免疫，是一種“抗炎性”巨噬細胞[27]。腫瘤中存在一群腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)，TAM并不是嚴格意義上的巨噬細胞亞群，其不在穩(wěn)態(tài)條件下存在，而是存在于許多腫瘤中。TAMs具有表型可塑性，其可在不同的微環(huán)境中會發(fā)生不同的極化，既可向炎性的M1型極化，也可向M2型(pro-tumor)分化，M2型巨噬細胞與腫瘤血管生成及代謝相關，并通過分泌細胞因子抑制T細胞功能，促進腫瘤生長[28-30]。成膠質(zhì)細胞瘤(GBM)細胞中ERK1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2)信號通路增強，腫瘤細胞產(chǎn)生大量單核細胞趨化因子CCL2/MCP1(chemokine C-C motif ligand 2/monocyte chemotactic protein 1)和CSF1/MCSF(colony-stimulating factor 1/monocyte colony-stimulating factor)，導致大量TAMs浸潤，并向M2極化，重塑腫瘤微環(huán)境。

5 PD-1在巨噬細胞上的表達及對巨噬細胞功能的調(diào)控

PD-1主要表達于活化的T淋巴細胞，目前大部分研究焦點都集中于T淋巴細胞PD-1的表達及對其的阻斷效應上。研究發(fā)現(xiàn)，PD-1在固有免疫應答中也可發(fā)揮作用。

PD-1的表達對DC細胞功能起負調(diào)控作用，PD-1敲除小鼠對李斯特菌感染的抵抗能力增強，分泌更多的IL-12和TNF-α[31]。PD-1在巨噬細胞中也有表達[32，33]，但相比于活化狀態(tài)的T淋巴細胞，巨噬細胞表面PD-1表達水平較低，需要一定的刺激活化，如LPS、IFN-α等[32-35]。當給予RAW264.7細胞系LPS刺激時，其會上調(diào)PD-1表達，并通過募集SHP-2到PD-1胞漿尾部結構域，抑制JNK(c-Jun N-terminal kinase)和PI3K/Akt信號通路活化，從而影響巨噬細胞功能成熟及共刺激分子表達[34]。

5.1PD-1與TAMs 有研究發(fā)現(xiàn)在病原體感染時，巨噬細胞會在腫瘤中表達高水平的PD-1，但其機制目前尚不明確。PD-1+TAMs有類似于M2型巨噬細胞的表面分子表達模式和功能，如CD206和IL-10表達持續(xù)增強；HLA-DR、CD64和IL-12表達降低；抑制CD8+T細胞能力顯著增強，其中單核細胞分化為PD-1+TAMs在腫瘤細胞浸潤并出現(xiàn)M2表型可能與腫瘤來源的外泌體相關[36]。而PD-1-TAMs的表達譜則與M1型巨噬細胞相似，Gordon等[37]發(fā)現(xiàn)PD-1+TAM吞噬腫瘤細胞能力受到抑制，提示阻斷PD-1/PD-L1通路治療可能通過影響巨噬細胞功能發(fā)揮抗腫瘤作用。有研究發(fā)現(xiàn)，當PD-1敲除后，酵母聚糖可促進炎癥發(fā)生，巨噬細胞向M1型而不是M2型極化，可能是由于PD-1敲除后胞內(nèi)STAT1/NF-κB活化增強，同時STAT6信號通路活化減弱。

5.2PD-1與巨噬細胞凋亡 PD-1在許多凋亡細胞上過表達，可介導T細胞凋亡[38]。有研究發(fā)現(xiàn)PD-1還與巨噬細胞的凋亡相關。雙氧水處理后的巨噬細胞PD-1表達增加，其通過PD-1-SHP2通路抑制細胞生長和存活通路AKT活化，導致巨噬細胞凋亡增加。而當杜氏利氏曼蟲感染巨噬細胞時，其可通過使活化T-細胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells，NFATc1)失活降低PD-1表達，從而抑制巨噬細胞凋亡[39，40]。

5.3巨噬細胞上PD-1的表達與炎癥 膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應綜合征，其過度且失控的炎癥反應會導致免疫功能障礙，最終造成持續(xù)感染和嚴重的機體損傷[41]。巨噬細胞在這個過程中起關鍵作用，因為固有免疫是宿主抵抗感染的第一道防線，巨噬細胞能高效清除病原體，并且是炎癥因子最重要的來源[42]。PD-1/PD-L1途徑可能對膿毒癥起重要調(diào)控作用。在膿毒癥發(fā)生過程中，腹腔巨噬細胞表達高水平PD-1，這與巨噬細胞失能相關。清除PD-1髓系敲除小鼠體內(nèi)的巨噬細胞后，小鼠抗菌能力減弱，炎癥因子增多，致死率升高。PD-1可能不僅是巨噬細胞失能的標志，也可能是調(diào)節(jié)固有免疫反應的重要靶點[33]。

6 小結

PD-1作為重要的免疫抑制分子，不僅在T、B淋巴細胞發(fā)揮功能，還在固有免疫細胞——巨噬細胞上有一定表達。高表達PD-1的巨噬細胞與腫瘤發(fā)生、細胞凋亡及炎癥發(fā)生息息相關。巨噬細胞上PD-1分子的表達及功能研究表明PD-1在固有免疫中也具有重要調(diào)控作用，為課題組針對免疫檢查點的治療提供了廣泛且具體的思路。