鯉春病毒血癥病毒的致病機(jī)理及防治研究進(jìn)展

孫翰昌，蔡明成

（重慶文理學(xué)院園林與生命科學(xué)學(xué)院，重慶 永川 402160）

鯉春病毒血癥（Spring viremia of carp，SVC）是由SVC 病毒（SVCV）引起的一種嚴(yán)重的傳染性病毒病，可造成鯉科（Cyprinidae）魚(yú)類(lèi)大量死亡[1]。SVCV 屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae），水泡病毒屬（Vesiculovirus），是 一 種 負(fù) 義 單 鏈RNA 病 毒[2]。SVCV 的 基 因組、結(jié)構(gòu)特征及其編碼蛋白的研究較多，但其作用機(jī)制的研究還處于探索階段，有研究認(rèn)為SVCV 感染誘發(fā)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡是其致病的重要途徑[3-4]。在藥物治療方面，血紅素加氧酶1（Heme Oxygenase-1，HO-1）[3]和香豆素[5]被認(rèn)為具有抗SVCV活性。在疫苗研究方面，SVC 疫苗質(zhì)量與其種類(lèi)、接種途徑和保護(hù)率相關(guān)，而目前還沒(méi)有商品化疫苗?？傮w來(lái)說(shuō)，對(duì)于SVC 的監(jiān)測(cè)需要更廣的范圍（包括地域、魚(yú)的種類(lèi)），SVCV 的致病機(jī)理需要更深入的研究，以構(gòu)建有效的預(yù)防與治療制度，減少SVC 帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。

因此，本文主要對(duì)SVCV 的生物特性、致病機(jī)理以及對(duì)SVC 藥物預(yù)防和疫苗開(kāi)發(fā)等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在總結(jié)歸納SVCV 相關(guān)的理論研究基礎(chǔ)，了解與SVC 藥物和疫苗相關(guān)的新技術(shù)和新方法，為該病毒疾病預(yù)防及綠色漁業(yè)發(fā)展積累參考資料。

1 SVCV 的研究進(jìn)展

1.1 SVCV 的結(jié)構(gòu)特征SVCV 外形為子彈狀，長(zhǎng)80 nm～180 nm，直徑為60 nm～90 nm[1]。其ssRNA 基因組大小約11 kb，編碼5 種結(jié)構(gòu)蛋白：核蛋白（N蛋白）、磷酸蛋白（P 蛋白）、基質(zhì)蛋白（M 蛋白）、糖蛋白（G 蛋白）和病毒依賴(lài)的RNA 聚合酶蛋白（L 蛋白）。其中G 蛋白主要通過(guò)形成三聚體誘導(dǎo)細(xì)胞的膜內(nèi)吞作用，是SVCV最重要的抗原呈遞蛋白[6]。N蛋白是高度富集的病毒蛋白，在RNA 互作中起重要作用；P蛋白包含了309個(gè)氨基酸殘基，在與N蛋白和L蛋白結(jié)合中發(fā)揮作用；M 質(zhì)蛋白位于SVCV 胞質(zhì)和囊膜之間，與胞內(nèi)的糖蛋白胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域相互作用，協(xié)助病毒的裝配和出芽；L 蛋白主要通過(guò)N 端與磷蛋白相結(jié)合，C 端與核蛋白相互作用來(lái)發(fā)揮自身酶活性，促進(jìn)病毒的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄[7]。SVCV的基因組中包含了一段潛在的N基因轉(zhuǎn)錄啟始序列，即AACAG。另外，其每個(gè)基因的末端存在一個(gè)保守的轉(zhuǎn)錄終止序列TATG（A）7[8]。

1.2 SVCV 的遺傳多樣性SVCV 大致可分為亞洲型和歐洲型。根據(jù)其G 蛋白序列的不同，SVCV 被進(jìn)一步分為Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc 和Ⅰd 4 種亞型[8]。其中Ⅰa亞型包含了從亞洲、歐美分離出來(lái)的病毒株；Ⅰb和Ⅰc 主要是從東歐分離出來(lái)的病毒株；Ⅰd 主要是從英國(guó)和一些歐洲國(guó)家分離出來(lái)的病毒株。然而，至今只有5 種病毒株的序列被完整地揭示，包括Fijian、Bjorklund、SVCV-A1、SVCV-C1 和SVCV-265。這5 種病毒株中均存在特異的氨基酸，且在5種蛋白中均有發(fā)現(xiàn)，可能是引起疾病臨床癥狀差異化表現(xiàn)的原因。

2 SVCV 的致病機(jī)理

2.1 SVCV 的附著與侵入病毒的侵入是一個(gè)較為復(fù)雜的過(guò)程，包含病毒與宿主細(xì)胞的識(shí)別、附著、侵入和自我復(fù)制等方面。更深入了解其感染機(jī)制可為疾病的治療提供有效的靶點(diǎn)，然而目前關(guān)于SVCV 的感染機(jī)制研究相對(duì)較少。已有研究表明，SVCV 主要通過(guò)G 蛋白參與細(xì)胞識(shí)別，并附著于細(xì)胞膜上。對(duì)于大多數(shù)病毒來(lái)說(shuō)，病毒感染促使宿主細(xì)胞分泌大量炎癥因子（如TNF-α）以阻斷病毒的粘附，然而SVCV 的附著不受TNF-α 的抑制[9-10]。隨后，在細(xì)胞胞吞作用下SVCV 被內(nèi)吞到細(xì)胞膜內(nèi)，其G 蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，觸發(fā)病毒由核內(nèi)體向細(xì)胞質(zhì)中釋放，完成其侵入細(xì)胞過(guò)程[9]。另外，SVCV的G 蛋白還可激活宿主細(xì)胞mTOR 信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞自噬反應(yīng)，促進(jìn)其自身基因組的復(fù)制[11]。

2.2 SVCV 與細(xì)胞自身免疫反應(yīng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面存在多種類(lèi)受體，觸發(fā)機(jī)體自身免疫反應(yīng)，抑制病毒的侵入和增殖[12]。主要包括TLRs（Toll-like receptors，TLRs）、RLRs（Retinoic acid-inducible gene 1 like receptors，RLRs）和HIN-200 家 族 受 體 等。其中，RLRs 可通過(guò)RNA 解旋酶結(jié)構(gòu)域識(shí)別病毒RNAs，激活線(xiàn)粒體抗病毒信號(hào)蛋白（Mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS）并發(fā)揮重要作用，包括病毒誘導(dǎo)信號(hào)適配體和IFN-β 啟動(dòng)刺激因子1等[12]。在 斑 馬 魚(yú)（Danio rerio）中，MAVS 和RIG-1（Retinoic acid-inducible gene 1，RIG-1）共 同 參 與SVCV 感染的調(diào)節(jié)。其中，RIG-1 存在兩個(gè)異變體（RIG-1a 和RIG-1b），RIG-1b 可通過(guò)激活I(lǐng)FN 抑制SVCV 活 性[13]；MAVS 有 兩 個(gè) 變 異 體，MAVS-tv1 和MAVS-tv2，但是其具體的調(diào)控作用并不清楚。而SVCV 的N 蛋白可靶向MAVS 抑制IFN1 的生成，促進(jìn)SVCV 的增殖[14]。

2.3 SVCV 與氧化應(yīng)激反應(yīng)氧化損傷被認(rèn)為是SVCV 感染的致病機(jī)制之一，鯉（Cyprinus carpio）抗氧化能力的提高可作為抵抗病毒的有效手段。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)HO-1 在病毒感染引起的氧化應(yīng)激、炎癥以及細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過(guò)程中均具有重要作用[3]。HO-1 是一種高度誘導(dǎo)性異型酶，催化亞鐵血紅素產(chǎn)生一氧化碳、膽紅素和鐵離子，抵抗氧化應(yīng)激[14]。在人類(lèi)中，HO-1 主要通過(guò)催化膽紅素誘導(dǎo)IFN 和一氧化氮分泌來(lái)抑制病毒的復(fù)制[15]。在HO-1調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，核轉(zhuǎn)錄因子EF-E2 相關(guān)因子2（Nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）作為HO-1 的上游調(diào)控因子，參與SVCV 的感染過(guò)程。在鯉魚(yú)上皮瘤細(xì)胞（Epitheliomapapulosumcyprini，EPC）中發(fā)現(xiàn)，Nrf2 ARE 信號(hào)通路的激活可抑制SVCV 的增殖[16]。且Nrf2的激活可促進(jìn)HO-1 和超氧化物歧化酶的分泌，進(jìn)一步證實(shí)了Nrf2 和HO-1 之間的調(diào)控作用[17]。另外，HO-1 主要通過(guò)cGMP/PKG 信號(hào)通路促進(jìn)一氧化碳的生成，最終抑制SVCV 的復(fù)制[3]。

2.4 SVCV 與細(xì)胞凋亡病毒感染過(guò)程伴隨著細(xì)胞凋亡，但各類(lèi)病毒引起細(xì)胞凋亡的作用方式不盡相同，是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。一方面，細(xì)胞凋亡與病毒在宿主體內(nèi)的自我復(fù)制相關(guān)；另一方面，病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡造成大量細(xì)胞死亡。然而，病毒的基因組大小決定了細(xì)胞凋亡是由病毒自我復(fù)制或誘導(dǎo)所引起。比如，與小基因組病毒相比，較大基因組的病毒具有更強(qiáng)的能力去改變宿主細(xì)胞的凋亡過(guò)程[18]。SVCV（小基因組）無(wú)法通過(guò)編碼基因來(lái)改變細(xì)胞凋亡過(guò)程；而皰疹病毒則可通過(guò)表達(dá)與宿主同源的基因來(lái)干擾機(jī)體免疫反應(yīng)和與細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號(hào)通路[19]。人皰疹病毒（較大基因組）主要通過(guò)表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡的同源蛋白Bcl-2、LANA 和vIL6 來(lái)抑制p53 和IFN-α 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[20]。在EPC 細(xì)胞中，SVCV 能夠引起細(xì)胞體積減小、胞質(zhì)出現(xiàn)空泡以及細(xì)胞核聚合和片段化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[21]。Kazachka 等認(rèn)為，SVCV 的復(fù)制以及子代病毒粒子的不斷產(chǎn)生是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的原因[22]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SVCV 通過(guò)促進(jìn)p53 和Caspase-9 基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)基因IAP 的表達(dá)。此外，SVCV 還可抑制HO-1 基因表達(dá)水平以促進(jìn)細(xì)胞凋亡[23]。

3 SVCV感染的藥物治療及疫苗開(kāi)發(fā)

3.1 SVCV 的藥物治療目前，針對(duì)SVCV 相關(guān)藥物的研究較多，但尚無(wú)商品化的特效藥。Shen 等研究發(fā)現(xiàn)一種牛蒡子苷元衍生物[Benzimidazolecoumarin derivative，7-（4-benzimidazole-butoxy）-coumarin，BBC]可抑制SVCV 感染，其作用原理為：（1）抑制SVCV 的G、P 和N 蛋白的表達(dá)；（2）促進(jìn)IFN-γ、IFN-φ1 和IFN-φ2 基因的表達(dá)，維持氧化還原反應(yīng)的平衡，提高機(jī)體的抗病毒能力，保護(hù)機(jī)體免受SVCV 感染引起的損傷[24]。在中藥香豆素類(lèi)化合物B4 和C2 對(duì)SVCV 的抑制率達(dá)到90%以上。從對(duì)SVCV 感染后的細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，B4 和C2 可保持細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和微結(jié)構(gòu)的完整性，防止細(xì)胞凋亡[5]。此外，香豆素類(lèi)化合物D5 可通過(guò)影響SVCV G蛋白的結(jié)構(gòu)，干擾SVCV 與細(xì)胞表面的附著，從而抑制病毒的感染。另一方面，D5 還可通過(guò)調(diào)節(jié)Akt-mTOR 信號(hào)通路抑制SVCV 誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬[5]。

此外，新技術(shù)的應(yīng)用也是治療SVCV 感染的手段之一。其中，RNA 干擾（RNA-mediated interference，RNAi）技術(shù)已被應(yīng)用于藥物治療。在魚(yú)類(lèi)疾病研究中，可以通過(guò)RNAi 技術(shù)開(kāi)發(fā)相關(guān)藥物治療病毒引起的各種疾病。例如，魚(yú)β-羅達(dá)病毒表達(dá)一種名為B2 的小型蛋白，可與病毒dsRNA 結(jié)合，防止其被Dicer 酶切割，從而抑制RNAi 技術(shù)相關(guān)藥物對(duì)病毒dsRNA 的沉默作用[25]。另一項(xiàng)關(guān)于草魚(yú)呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）的研究發(fā)現(xiàn)，GCRV 的dsRNA 可激活RNAi 機(jī)制，促進(jìn)肝臟中Dicer 酶的高表達(dá)[26]。另外，針對(duì)于SVCV 的N 和P 轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行siRNA 設(shè)計(jì)，發(fā)現(xiàn)該siRNA 可有效抑制病毒N 和P 基因的表達(dá)，抑制SVCV 的復(fù)制[27]。

3.2 SVCV 的疫苗開(kāi)發(fā)SVCV 的疫苗研制還處于探索階段，主要有滅活疫苗、弱毒疫苗、核酸疫苗和亞單位疫苗。其中，滅活疫苗保護(hù)率低，且保護(hù)持續(xù)時(shí)間較短；弱毒疫苗存在較多限制，主要包括病毒弱化不當(dāng)、保護(hù)效果的定量評(píng)估、病毒毒力返強(qiáng)隱患以及市場(chǎng)限制和法律監(jiān)管等。在DNA 疫苗研發(fā)方面，從三文魚(yú)胰腺疾病的DNA 疫苗被認(rèn)證后，魚(yú)類(lèi)DNA 疫苗向商業(yè)化跨出重要的一步。至今，關(guān)于魚(yú)類(lèi)彈狀病毒科的有效DNA 疫苗的報(bào)道較多，如虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、大菱鲆（Scophthatmus maximus）以及太平洋鯡魚(yú)（Clupea pallasi）的病毒性出血敗血癥病毒DNA 疫苗[28]。然而，SVCV DNA 疫苗的保護(hù)效果卻不理想，明顯低于其它彈狀病毒科疫苗。為此，Kanelllos 等根據(jù)SVCV G 蛋白設(shè)計(jì)了10種DNA 疫苗，但其保護(hù)率僅在11%～33%之間；而使用表達(dá)全長(zhǎng)G 基因的二聯(lián)苗時(shí)，其保護(hù)率提高到48%[29]。最近，對(duì)SVCV-G DNA 疫苗的研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)鯉魚(yú)提供的保護(hù)率高達(dá)100%，且該疫苗主要通過(guò)激活B 細(xì)胞和T 細(xì)胞，為鯉魚(yú)提供獲得性免疫反應(yīng)[28]。雖然DNA 疫苗被認(rèn)為是有效的抗病毒手段，但動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)、勞動(dòng)力以及高成本限制了DNA 疫苗的大規(guī)模使用。在亞單位疫苗方面，口服乳酸桿菌融合表達(dá)SVCV-G 基因的疫苗后，對(duì)鯉魚(yú)的保護(hù)率達(dá)到71%，而對(duì)錦鯉（Cyprinuscarpio haematopterus）的保護(hù)率為53%[30]；利用昆蟲(chóng)桿狀細(xì)胞表達(dá)的SVCV 亞單位疫苗浸浴免疫后，對(duì)鯉魚(yú)的保護(hù)率最高僅為34%[31]。

隨著納米技術(shù)的不斷發(fā)展，具有優(yōu)越的跨膜性、承載能力強(qiáng)及穩(wěn)定性好的碳納米管在疫苗接種方面具有廣泛的應(yīng)用。雖然有報(bào)道碳納米管注射會(huì)引起毒性反應(yīng)，但進(jìn)一步對(duì)碳納米管進(jìn)行功能化修飾后，其引起的毒性不明顯[32]。因此，碳納米管的使用有望解決水產(chǎn)動(dòng)物中疫苗接種途徑的難題。Zhu 等以碳納米管作為疫苗載體，裝載草魚(yú)呼腸孤病毒vp7 基因的DNA 疫苗，接種草魚(yú)后發(fā)現(xiàn)該疫苗可激活機(jī)體先天和獲得性免疫反應(yīng)，且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，與傳統(tǒng)的DNA 疫苗相比，其對(duì)草魚(yú)最高相對(duì)保護(hù)率為100%[33]。另外，浸浴和注射單壁碳納米管SVCV 疫苗可顯著提高鯉的血清抗體效價(jià)水平以及抗氧化能力，與免疫相關(guān)基因（如TNF-α、IL-10以及Cxcr1 等）的表達(dá)水平顯著升高，其免疫保護(hù)率分別高達(dá)63.5%和73.1%[34]。

目前研發(fā)的SVCV 疫苗雖然成本、接種途徑和保護(hù)率三方面不能滿(mǎn)足規(guī)?；a(chǎn)以及市場(chǎng)投放。但是，從已有的研究可知，DNA 疫苗在保護(hù)率方面具有較明顯優(yōu)勢(shì)，尤其是針對(duì)于SVCV G 基因?yàn)榘悬c(diǎn)的DNA 疫苗。再結(jié)合納米技術(shù)的運(yùn)用，可解決SVCV 疫苗在接種途徑和效率中的限制，相對(duì)減少成本投入，有望實(shí)現(xiàn)SVCV 疫苗的成功研制。

4 小結(jié)與展望

鯉是我國(guó)養(yǎng)殖歷史最悠久的大宗淡水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖品種之一，近年來(lái)，鯉（包括錦鯉）暴發(fā)性死亡的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，呈現(xiàn)出發(fā)病速度快、死亡率高的特點(diǎn)，病害嚴(yán)重時(shí)發(fā)病后3 d 內(nèi)死亡率達(dá)到90%以上，經(jīng)前期流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SVCV 是造成該類(lèi)病害的主要病原之一。目前，SVCV 基因組序列、蛋白組成和病毒結(jié)構(gòu)的研究已比較清楚，但致病途徑和機(jī)理還需深入研究，治療藥物和疫苗還具有很大的開(kāi)發(fā)前景。因此，結(jié)合已有的研究結(jié)果，擬從以下幾方面對(duì)SVCV 進(jìn)行研究：（1）進(jìn)一步優(yōu)化鯉養(yǎng)殖環(huán)境因子、營(yíng)養(yǎng)指數(shù)、群體行為特性的各技術(shù)環(huán)節(jié)，智能化監(jiān)測(cè)鯉健康養(yǎng)殖過(guò)程中的各類(lèi)參數(shù)，動(dòng)態(tài)調(diào)整鯉預(yù)防技術(shù)指標(biāo)，培育無(wú)特定病原鯉親本，繁育無(wú)特定病原（鯉春病毒、錦鯉皰疹病毒等）的鯉苗種；（2）以SVCV 的G蛋白作為靶點(diǎn)，研究并篩選阻斷病毒與細(xì)胞附著的藥物；（3）通過(guò)碳納米管-甘露糖-SVCV 疫苗復(fù)合物，積極研究和開(kāi)發(fā)SVCV DNA 疫苗；（4）探索一種基于激活鯉自身特異性免疫與生物藥物相結(jié)合的鯉病毒性疾病生物防控技術(shù)體系，為提高商品鯉養(yǎng)殖品質(zhì)及養(yǎng)殖效益奠定基礎(chǔ)。