江蘇某肉雞屠宰場彎曲菌耐藥性及aadE-sat4-aphA-3耐藥基因簇分布分析

張小燕，周 倩，唐夢君，蒲俊華，張 靜，陳大偉，陸俊賢，高玉時

（江蘇省家禽科學研究所，江蘇 揚州 225125）

彎曲菌（Campylobacter）尤其是空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni，C. jejuni）和結腸彎曲菌（Campylobacter coli，C.coli）是世界范圍內最重要的人獸共患食源性病原菌[1]。人感染彎曲菌的臨床表現(xiàn)主要為腹瀉、發(fā)熱、頭痛或伴有嘔吐癥狀，空腸彎曲菌感染也可能導致一些自身免疫性疾病如格林巴利綜合征和米勒費歇綜合征[2]。多位點序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）研究結果表明家禽是人感染彎曲菌的最重要來源[3-4]。雞腸道內彎曲菌定殖量可高達8.6log cfu/g，并保持這種感染狀態(tài)直至屠宰[5-6]，容易造成屠宰、加工及零售環(huán)節(jié)禽肉及其產品的污染。

近年來，人醫(yī)臨床用藥和畜牧業(yè)抗菌藥物的大量使用甚至是濫用對包括彎曲菌在內的病原菌產生了選擇性壓力，促進耐藥彎曲菌的產生和流行[7]。

對于彎曲菌引發(fā)的腸胃疾病如腹瀉、便血等首選氟喹諾酮類和大環(huán)內酯類抗菌藥物治療，而當發(fā)生全身性感染如菌血癥時，氨基糖苷類（尤其是慶大霉素）則是最佳治療藥物[8]。氨基糖苷類抗生素在畜禽養(yǎng)殖過程中的不規(guī)范使用造成了該類抗生素耐藥彎曲菌甚至多重耐藥彎曲菌的產生和傳播，致使我國彎曲菌多重耐藥情況嚴重[9]。為了解肉雞屠宰場彎曲菌耐藥性及氨基糖苷耐藥基因簇aadE-sat4-aphA-3 的分布特點，本研究對江蘇某肉雞屠宰場彎曲菌分離株進行耐藥性分析，采用PCR檢測aadE-sat4-aphA-3 耐藥基因簇分布情況，并檢測部分該基因簇陽性菌株對氨基糖苷類藥物的MIC值，以期為彎曲菌氨基糖苷類藥物耐藥機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌 株117 株彎曲菌分離自江蘇某一肉雞屠宰場加工生產鏈采集的3 批次樣品（泄殖腔棉拭、脫毛后胴體、開膛后胴體、消毒后胴體、成品雞及操作臺面和操作人員手套擦拭樣品），該3 批次樣品中的肉雞樣品來自江蘇省3 個不同的養(yǎng)殖場，時間分別為2017 年4 月（39 株）、8 月（38 株）和11 月（40株）。質控菌為空腸彎曲菌標準菌株（ATCC33560）購自中國微生物菌種保藏中心。

1.2 主要試劑彎曲菌CCDA 瓊脂培養(yǎng)基、MH 培養(yǎng)基、BHI 培養(yǎng)基等均購自OXOID 公司；脫纖維綿羊全血購自青島海博生物技術有限公司；9 大類26 種畜禽養(yǎng)殖常用抗菌藥物藥敏紙片均購自OXOID公司；卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星、鏈霉素、慶大霉素等藥物均購自博邁德生物（Biomed）制品公司；微生物基因組提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Buffer、dNTPs、TaqDNA 聚合酶、DNA Marker 均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 分離菌株的藥物敏感性試驗將117 株分離菌接種于含5%脫纖維羊血的MH 培養(yǎng)基，置42 ℃微需氧條件下培養(yǎng)36 h～48 h 后，制備0.5 麥氏濃度菌懸液。參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）推薦方法對彎曲菌進行9 大類26 種抗生素的藥敏試驗，本實驗結果為中度敏感的菌株均統(tǒng)計為敏感，耐藥菌株占比為0 則表示所有受試菌株均對該種藥物敏感。

1.4 分離菌株氨基糖苷類耐藥基因簇aadE-sat4-aphA-3的檢測以提取的分離菌基因組DNA 為模板，參照文獻[10]，采用PCR 檢測aadE-sat4-aphA-3耐藥基因簇，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產物，并經(jīng)測序鑒定，對檢測結果進行統(tǒng)計分析。

1.5 部分菌株的MIC 值測定采用CLSI 推薦的瓊脂稀釋法[11]測定彎曲菌對5 種氨基糖苷類抗生素卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素、鏈霉素的敏感性，以空腸彎曲菌ATCC33560作為質控菌株。

2 結果與討論

2.1 藥敏試驗結果肉雞屠宰場3 批次分離的彎曲菌耐藥性結果顯示，共117 株彎曲菌對鏈霉素和卡那霉素的耐藥菌株占比均為93.2%（109/117），對妥布霉素的耐藥菌株占比為80.3%（94/117），對阿米卡星的耐藥菌株占比為36.8%（42/117），對慶大霉素的耐藥菌株占比為42.7%（50/117），對頭孢氨芐的耐藥菌株占比為96.6%（113/117），對氟喹諾酮類藥物耐藥菌株占比均大于89.7%（105/117），大環(huán)內酯類藥物（59.8%）（70/117）、碳青霉烯類藥物（1.7%～17.1%）（2/117～20/117）、氯霉素類藥物（10.3%～17.9%）（12/117～21/117）耐藥菌株占比相對較低；第1 批次所有分離菌株均對大環(huán)內酯類藥物（紅霉素、阿奇霉素）敏感，但第2、3 批次分離菌株對上述大環(huán)內酯類藥物耐藥的菌株占比均分別為81.6%（31/38）和100%（40/40）；受試的117 株分離菌中除第2 批次的7 株菌不具有多重耐藥性（耐3 類及以上藥物）外，其它110 株分離菌（94%）均表現(xiàn)出多重耐藥性。菌株的耐藥類型指該菌株耐藥的抗生素種類數(shù)與受測的抗生素總數(shù)的比值，如測定某一菌株對10 種抗生素的耐藥性，如果該菌對其中6 種抗生素均具有耐藥性，則該菌株的耐藥類型為0.6。本研究117 株分離的彎曲菌耐藥類型結果顯示，大部分菌株的耐藥類型集中于0.7～0.9（圖1）。以上結果表明江蘇某肉雞屠宰場分離的彎曲菌對畜禽養(yǎng)殖常用的抗菌藥物耐藥性較強且存在多重耐藥現(xiàn)象。同一批次菌株因其來源于同一養(yǎng)殖場因而具有相似的耐藥特性。研究表明彎曲菌感染與季節(jié)及溫度有很大的相關性[12]。彎曲菌雖然不能使雞發(fā)病，但肉雞在飼養(yǎng)過程中易感染大腸桿菌、球蟲病及呼吸道疾病等，養(yǎng)殖戶會根據(jù)肉雞飼養(yǎng)階段發(fā)病規(guī)律和外界環(huán)境變化等因素制定不同日齡肉雞的用藥程序，因此外界環(huán)境如溫度和季節(jié)不同，養(yǎng)殖場用藥可能會存在一定的差異。本研究3 批次樣品來源于3 個不同的養(yǎng)殖場，其耐藥性的差異可能與不同養(yǎng)殖場的用藥差異相關。

圖1 分離的彎曲菌耐藥類型的統(tǒng)計分析結果Fig.1 Analysis of resistant type of Campylobacter isolates

近年來監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示我國臨床分離的彎曲菌對氟喹諾酮耐藥的菌株占比在1994 年～2010 年間從50%上升至100%[13]。彎曲菌對多種抗生素耐藥情況比較嚴重，其中對環(huán)丙沙星和四環(huán)素耐藥的食品動物源彎曲菌株占比接近100%，對紅霉素耐藥的雞源結腸彎曲菌占比從2008 年～2009 年的48.7%上升至2012 年～2014 年的76.4%，對慶大霉素耐藥菌株占比從20%升高至80%，且多重耐藥情況嚴重[9,14]。多重耐藥彎曲菌具有通過食品源動物將細菌耐藥性傳遞給人類的風險[15]。本研究結果進一步表明我國彎曲菌耐藥的嚴重性。因此建議畜禽養(yǎng)殖應正確合理用藥，避免抗菌藥物的濫用尤其是預防性抗菌藥物的不合理使用；其次相關部門要進一步加強對彎曲菌耐藥性的監(jiān)測，深入研究其對不同類藥物耐藥的機理，以便針對耐藥菌研發(fā)新型抗菌藥物。

2.2 分離菌aadE-sat4-aphA-3耐藥基因簇的檢測結果采用PCR 檢測分離的彎曲菌中氨基糖苷類耐藥基因簇aadE-sat4-aphA-3。結果顯示，共有90 株彎曲菌中擴增到長度約為1 500 bp 的目的片段，對部分菌株PCR 產物測序比對后確定其為氨基糖苷類耐藥基因簇aadE-sat4-aphA-3，部分菌株的PCR 擴增結果如圖2。該基因簇檢出率為76.9%，共有17株空腸彎曲菌，73 株結腸彎曲菌檢出該耐藥基因簇。結果表明該耐藥基因簇在肉雞屠宰場來源的彎曲菌中陽性率較高，可能與分離菌株對氨基糖苷類藥物的耐藥性有關。

氨基糖苷類耐藥基因簇aadE-sat4-aphA-3 于2004 年首次在空腸彎曲菌質粒中發(fā)現(xiàn)，目前已陸續(xù)報道其在彎曲菌的質粒和染色體中均出現(xiàn)，該耐藥基因簇的出現(xiàn)與彎曲菌受多種氨基糖苷類抗生素的選擇壓力有關[16]。而本研究中aadE-sat4-aphA-3 基因簇陽性率為76.9%，與以往研究結果[10,17-18]相比均較高，這可能與屠宰場3 個批次分離菌株均來自于江蘇省有關。

圖2 部分分離菌株aadE-sat4-aphA-3 基因簇的PCR 檢測結果Fig.2 The detection results of aadE-sat4-aphA-3 in partial isolates by PCR

2.3aadE-sat4-aphA-3陽性彎曲菌MIC 值的測定結果選取20 株aadE-sat4-aphA-3 陽性彎曲菌進行氨基糖苷類5 種抗菌藥物敏感性試驗。參照文獻標準[11]，菌株對慶大霉素、鏈霉素和妥布霉素的MIC值≥8 μg/mL 為耐藥，對卡那霉素和阿米卡星MIC 值≥64 μg/mL 為耐藥。結果顯示，第1、3 批次所有菌株均對卡那霉素、妥布霉素、鏈霉素耐藥，其中13株該基因簇陽性菌對妥布霉素耐藥性較強（MIC 值為512 μg/mL）；第2 批次有2 株菌均對卡那霉素、妥布霉素、鏈霉素耐藥（MIC 值≥128 μg/mL），其余菌株對除卡那霉素外的其余4 種藥物均敏感。20 株aadE-sat4-aphA-3 基因簇陽性彎曲菌中共有12 株對慶大霉素耐藥，MIC 值最高為256 μg/mL；共有11株菌對受試的5 種氨基糖苷類藥物均耐藥，且大部分菌株對阿米卡星、妥布霉素的MIC 值≥256 μg/mL（表1）。上述結果表明，aadE-sat4-aphA-3 基因簇陽性彎曲菌對氨基糖苷類藥物有較強的耐藥性。

表1 20 株aadE-sat4-aphA-3 陽性彎曲菌對氨基糖苷類藥物的MIC 值Table 1 MIC value of 20 aadE-sat4-aphA-3 positive strains to aminoglycosides

大環(huán)內酯類藥物是臨床上治療彎曲菌病的首選藥物，但對于彎曲菌引起的重度感染、急性和全身性感染，則需用氨基糖苷類藥物（慶大霉素、阿米卡星和鏈霉素）治療[19-20]。國內養(yǎng)殖場常利用某些氨基糖苷類藥物如阿米卡星和慶大霉素預防和治療畜禽細菌性疾病，將安普霉素（氨基糖苷類藥物）添加于飼料或飲水中用于促進畜禽的生長，這在一定程度上造成氨基糖苷類藥物耐藥彎曲菌的產生和傳播。本研究隨機選擇的20 株氨基糖苷類耐藥基因簇陽性彎曲菌中有11 株對受試的5 種氨基糖苷類藥物均耐藥，且大部分分離菌對阿米卡星、妥布霉素的MIC 值≥256 μg/mL。提示攜帶aadE-sat4-aphA-3 基因簇的彎曲菌有可能給公共衛(wèi)生和人類健康帶來一定風險，進一步開展對aadE-sat4-aphA-3 耐藥基因簇陽性彎曲菌的監(jiān)測和傳播特點研究很有必要。