Gasdermin D的結(jié)構(gòu)功能及在病原感染防御中的作用

李嘉琪，周作勇,2，王芝英,2

(1.西南大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，重慶 榮昌 402460；2.重慶市獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心，重慶 榮昌 402460)

Gasdermin D(GSDMD)蛋白屬于Gasdermin(GSDM)家族，是介導(dǎo)細(xì)胞焦亡(Pyroptosis)的重要蛋白[1]，在先天免疫防御和致死性內(nèi)毒素血癥中有重要作用。本文主要對GSDMD的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、介導(dǎo)細(xì)胞焦亡和IL-1釋放的機(jī)制，以及在病原體感染防御中的作用進(jìn)行綜述。

1 GSDMD蛋白概述

1.1 GSDMD結(jié)構(gòu) GSDMD分子量為53 kD，約含480個(gè)氨基酸，包括2個(gè)結(jié)構(gòu)域，GSDMD的C端結(jié)構(gòu)域(GSDMD-C)和GSDMD的N端結(jié)構(gòu)域(GSDMD-N)，GSDMD-C為包含9個(gè)α-螺旋被反向平行的β12-β14覆蓋的球狀結(jié)構(gòu)，GSDMD-N的核心是延伸、扭曲的β-折疊，域間存在2個(gè)相互作用位點(diǎn)[1-6]。GSDMD-C對GSDMD-N發(fā)揮抑制作用，GSDMD-C的第1個(gè)環(huán)(276～296AA)插入至GSDMD-N中，在穩(wěn)定自抑制中起重要作用，接頭序列替換該區(qū)域后細(xì)胞死亡水平上升[7]。由于GSDMD在原生狀態(tài)下易形成高階低聚物，目前尚未獲得GSDMD高分辨率三維結(jié)構(gòu)信息。GSDMA3與GSDMD的同源性達(dá)70%，Ding J等[5]根據(jù)同源性建模預(yù)測GSDMD的結(jié)構(gòu)，如中插彩版圖1。

1.2 Gasdermin家族 GSDMD是約有45%序列同源性的GSDM家族蛋白，GSDM家族在脊椎動物中保守[3-4]。人類GSDM家族包括GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME和DFNB59，小鼠無GSDMB，但是有3個(gè)GSDMA同系物(GSDMA1～3)和4個(gè)GSDMC同系物(GSDMC1～4)[1]。在GSDM家族中，除DFNB59外都存在雙域結(jié)構(gòu)，能在細(xì)胞焦亡中形成膜孔的Gasdermin的N端結(jié)構(gòu)域(GSDM-N)是最保守的結(jié)構(gòu)域[5]。由此，細(xì)胞焦亡可重新定義為由GSDM介導(dǎo)的程序性壞死?？赡苡捎诮Y(jié)構(gòu)域間作用位點(diǎn)、作用模式不同，GSDM家族中其他蛋白尚未被發(fā)現(xiàn)能作為炎性Caspase底物[1,8]，是否能夠釋放GSDM-N介導(dǎo)細(xì)胞焦亡有待進(jìn)一步研究。

2017年首次發(fā)現(xiàn)，在TNF或化療藥物誘導(dǎo)下，GSDME的N端結(jié)構(gòu)域釋放，使半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡切換為細(xì)胞焦亡，敲除Gsdme基因小鼠可避免化療帶來的組織損傷和體重減輕[9]。其他GSDM蛋白的GSDM-N激活機(jī)制與功能仍待探索，Gsdmb基因等突變致病(尤其以炎癥為特征的疾病)是否由于釋放了有成孔活性的GSDM-N并觸發(fā)細(xì)胞焦亡，可作為研究致病機(jī)制新方向。

2 GSDMD調(diào)控細(xì)胞焦亡

2.1 切割GSDMD釋放細(xì)胞焦亡活性片段GSDMD-N 目前，GSDMD激活細(xì)胞焦亡主要有經(jīng)典和非經(jīng)典2條路徑。經(jīng)典路徑由Caspase-1介導(dǎo)，炎性體識別病原微生物、內(nèi)源性威脅后招募激活Caspase-1，活化的Caspase-1特異性切割GSDMD[1]。也有研究表明，未被激活的Caspase-1前體同樣可切割活化GSDMD，GSDMD的切割與Caspase-1的激活可能是平行過程[3]。非經(jīng)典路徑中，小鼠Caspase-11及其人直系同源物Caspase-4、5與LPS直接結(jié)合發(fā)生寡聚活化，切割GSDMD后破壞其自身抑制作用，得到GSDMD-N和GSDMD-C[1-2]。GSDMD-N誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞焦亡，GSDMD和GSDMD-C則毒性較小，未表現(xiàn)出誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的功能[1,3,5]。因此，真正引起細(xì)胞焦亡的是GSDMD-N，GSDMD-C可通過與GSDMD-N結(jié)合，抑制細(xì)胞焦亡。最近研究發(fā)現(xiàn)，耶爾森氏菌感染巨噬細(xì)胞后，其毒力蛋白YopJ通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子激酶1(TAK1)，活化Caspase-8并切割GSDMD，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[10]。而中性粒細(xì)胞中，彈性蛋白酶(Neutrophil elastase，ELANE)可切割活化GSDMD，釋放GSDMD-N，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞溶解性死亡，其切割位點(diǎn)位于Caspase切割位點(diǎn)上游[11]。

2.2 GSDMD-N片段形成膜孔觸發(fā)細(xì)胞焦亡 顯微成像發(fā)現(xiàn)，GSDMD-N由細(xì)胞質(zhì)靶向細(xì)胞膜，細(xì)胞出現(xiàn)特征性的膨脹氣泡并破裂[5]。GSDMD-N可與真核細(xì)胞膜上特有的磷酸化磷脂酰肌醇和原核細(xì)胞膜上特有的心磷脂結(jié)合，并在含有磷酸肌醇、心磷脂的脂質(zhì)體或是天然極性油脂混合物的脂質(zhì)體上廣泛成孔[5,12]。由于磷脂酰肌醇在質(zhì)膜上的不對稱分布，GSDMD-N只從內(nèi)部引起哺乳動物細(xì)胞裂解，不會傷害鄰近哺乳動物細(xì)胞[12]。GSDMD-N通過電荷-電荷相互作用寡聚化，形成約16元對稱原體(Protomers)的分子孔道，內(nèi)徑為10～16 nm，該孔徑大小可允許成熟的IL-1β、IL-18通過[5,7]?？椎佬纬蛇^程中無需其他蛋白作為膜受體或輔助因子，形成后可破壞細(xì)胞膜的正常滲透屏障，水和離子涌入，細(xì)胞體積增大、腫脹破裂，觸發(fā)細(xì)胞焦亡[6,13]。目前，GSDMD未顯示與任何已知的成孔毒素有顯著同源性，GSDMD孔道的高分辨率結(jié)構(gòu)未知。

3 GSDMD調(diào)控IL-1釋放

IL-1家族的細(xì)胞因子是胞質(zhì)蛋白，釋放至胞外后表現(xiàn)促炎活性。其中，IL-1β成熟分泌是經(jīng)典炎性體激活的主要反應(yīng)之一。研究表明，激活炎性體后，Gsdmd基因缺失巨噬細(xì)胞不能完成IL-1β 的成熟分泌[1]。進(jìn)一步觀察鼠傷寒沙門菌感染的Gsdmd基因缺失巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)成熟IL-1β的分泌受到抑制[1]。由此確認(rèn)，GSDMD不影響IL-1β成熟，但在成熟形式IL-1β分泌中起重要作用。

通常認(rèn)為IL-1釋放過程發(fā)生細(xì)胞死亡之后，但最新研究表明，巨噬細(xì)胞可達(dá)到超活化狀態(tài)，在分泌IL-1的同時(shí)仍保持活力，GSDMD孔道對于IL-1β通過完好的脂質(zhì)雙分子層和分泌IL-1β是必需的[14]。GSDMD孔道除介導(dǎo)細(xì)胞焦亡外，可能是巨噬細(xì)胞在超活化條件下分泌細(xì)胞因子的通道。

4 GSDMD在病原感染防御中的作用

4.1 GSDMD與細(xì)菌性病原感染 最初認(rèn)為，細(xì)胞焦亡可釋放免疫逃避的胞內(nèi)菌，使其被中性粒細(xì)胞吞噬、減少復(fù)制，實(shí)現(xiàn)防御細(xì)菌感染。但最近研究表明，細(xì)胞焦亡培養(yǎng)上清液可殺死游離細(xì)菌，隨著GSDMD-N的消耗，殺傷作用被抑制，而納摩爾濃度GSDMD-N即可結(jié)合并殺死革蘭陰性和革蘭陽性菌[11]。在哺乳細(xì)胞內(nèi)，GSDMD-N的過表達(dá)對胞內(nèi)菌同樣表現(xiàn)殺傷作用[12]。以上試驗(yàn)結(jié)果均提示GSDMD-N有直接殺菌作用，目前已有研究表明，心磷脂可從細(xì)菌內(nèi)膜轉(zhuǎn)移到外膜，GSDMD-N可能通過靶向裂解細(xì)菌外膜，清除細(xì)菌[15]。但仍缺乏對GSDMD-N殺菌過程的可視化試驗(yàn)，同時(shí)需要確定GSDMD-N是否對機(jī)體控制感染產(chǎn)生重要影響。而心磷脂同樣是線粒體內(nèi)膜的重要組分，對于GSDMD-N能否裂解線粒體尚無研究。

4.2 GSDMD與病毒性病原感染 GSDMD主要通過介導(dǎo)細(xì)胞焦亡，參與機(jī)體對病毒感染的先天免疫防御。腸道病毒71型，可通過病毒3C蛋白酶破壞GSDMD-N的完整性，抑制細(xì)胞焦亡實(shí)現(xiàn)自身復(fù)制[16]。炎性體NLRP9識別輪狀病毒后激活細(xì)胞焦亡，限制病毒復(fù)制，敲除Gsdmd基因?qū)⒃黾訉啝畈《疽赘行訹17]。黑素瘤缺乏因子2(AIM2)識別人腺病毒后，可激活GSDMD介導(dǎo)的人單核細(xì)胞衍生樹突狀細(xì)胞焦亡[18]。干擾素誘導(dǎo)蛋白16(IFI16)識別人類免疫缺陷病毒(HIV)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，引起CD4+T淋巴細(xì)胞焦亡，嚴(yán)重破壞免疫系統(tǒng)，Caspase-1抑制劑使CD4+T淋巴細(xì)胞在體外感染HIV時(shí)仍保存活力[19-20]。目前GSDMD在CD4+T淋巴細(xì)胞耗竭過程中的作用有待證實(shí)，有望為治療HIV免疫缺陷提供新靶點(diǎn)。

5 小結(jié)與展望

細(xì)胞焦亡通路中，炎性Caspase底物GSDMD的發(fā)現(xiàn)，改變了以往對細(xì)胞焦亡的認(rèn)知，GSDMD-N作為細(xì)胞焦亡直接執(zhí)行者，通過在膜上成孔實(shí)現(xiàn)細(xì)胞焦亡特征性的腫脹破裂。目前，GSDMD精細(xì)結(jié)構(gòu)及GSDMD-N在膜上形成孔道的結(jié)構(gòu)和生化機(jī)制仍需更多基礎(chǔ)研究，比如，巨噬細(xì)胞在超活化與細(xì)胞焦亡間切換是否與GSDMD孔道形成程度不同有關(guān)等，對調(diào)節(jié)先天免疫功能有重要意義。在宿主防御細(xì)菌感染的研究中，盡管GSDMD表現(xiàn)出直接殺死細(xì)菌的特性，目前仍需進(jìn)一步研究確定其應(yīng)用的廣泛性和對控制體內(nèi)感染的意義。而GSDMD在參與病原感染防御時(shí)，可能介導(dǎo)嚴(yán)重、廣泛的內(nèi)皮細(xì)胞焦亡，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失調(diào)，引起急性肺損傷等。對此，Rathkey J K等已研究發(fā)現(xiàn)，化學(xué)小分子Necrosulfonamide通過結(jié)合GSDMD的C191位抑制其寡聚化，從而阻斷細(xì)胞焦亡[21]。若能通過控制GSDMD，進(jìn)一步協(xié)調(diào)好細(xì)胞焦亡程度，可為治療敗血癥等炎癥性疾病提供更多啟示。